肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、。Y 9 5 二9 3 l梗宴父。。孥。， ／一博士學(xué)位論文肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋自質(zhì)組學(xué)研究脘。 系：專 業(yè)：姓 名：指導(dǎo)教師：蠢。濺日期：化學(xué)系分析化學(xué)申華莉楊艽原教授2 0 0 6 年4 月1 0 日學(xué)校代碼： 1 0 2 4 6學(xué) 號(hào)：0 3 1 0 2 2 0 1 3復(fù)巨大學(xué)博士畢業(yè)論文D N A ／R N A 結(jié)合蛋白，h n R N P 蛋白，延長(zhǎng)因子以及代謝相關(guān)蛋白，并對(duì)其中幾個(gè)h n R N P 家族蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證。本論文由

2、四部分組成。第一章緒論首先概述了蛋白質(zhì)組學(xué)作為一門(mén)新興學(xué)科，它的發(fā)展現(xiàn)狀和最新的技術(shù)進(jìn)展，包括雙相凝膠電泳技術(shù)，生物質(zhì)譜技術(shù)，色譜分離技術(shù)，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，酵母雙雜交技術(shù)和串聯(lián)親和純化技術(shù)等。然后概述了肝蛋白質(zhì)組研究的進(jìn)展，提出本課題工作的研究方向。第二章所述工作采用雙相凝膠電泳和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究了純化的C 5 7 小鼠核蛋白的全表達(dá)譜。首先通過(guò)多次密度梯度離心分離得到純化的細(xì)胞核，通過(guò)電鏡照片和w e s t e r n - b l

3、o t 等方法驗(yàn)證，證實(shí)了細(xì)胞核純度達(dá)到9 0 ％以上，保證了后續(xù)工作的意義。對(duì)提取的核蛋白分別應(yīng)用非線性p H 3 ～1 0 ，和線性p H 4 ～7 ，長(zhǎng)2 4 c m 的固定口H 梯度的I P G 膠條和1 2 ．5 ％的S D S —P A G E 進(jìn)行雙相凝膠電泳分離總蛋白，得到的凝膠分別進(jìn)行了銀染和考馬斯亮蘭染色。將所有膠上蛋白點(diǎn)切下進(jìn)行膠內(nèi)酶解，質(zhì)譜鑒定。本工作成功鑒定了1 1 9 3 個(gè)鼠肝核蛋白，其中包括一些細(xì)胞定位不

4、明的蛋白( 4 0 ％) ，本工作為這些蛋白提供了可能的細(xì)胞定位。第二大類(lèi)蛋白即為核蛋白( 2 0 ％) ，其它一些蛋白以前未被定位于細(xì)胞核的，本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)說(shuō)明它們有可能共定位于細(xì)胞核。其中發(fā)現(xiàn)了很多D N 刪A 結(jié)合蛋自，參與核酸的調(diào)控和修飾等。在鑒定蛋白的同時(shí)，對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了一些P M F 和串級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定的矛盾信息，通過(guò)對(duì)這些信息的分析，一方面存在一些可能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，另一方面也提示了目前檢索條件可能引入假陽(yáng)

5、性鑒定的不足，提示我們?cè)谖磥?lái)的研究工作中，若想得到高準(zhǔn)確的鑒定，需要適當(dāng)提高鑒定標(biāo)準(zhǔn)。第三章所述工作研究高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌裸鼠模型L C I —D 2 0 的全蛋白表達(dá)譜。對(duì)組織蛋白進(jìn)行一步提取和順序提取，得到的組分T o Ⅱe ，E l ，E 2 和E 3 分別用雙相凝膠電泳和多維液相色譜方法分離，然后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。共有9 9 5 個(gè)非冗余蛋白得到鑒定，其中發(fā)現(xiàn)了很多肝癌及肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，包括常見(jiàn)的或文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的肝癌或轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，如

6、甲胎蛋白，m s 蛋白，熱休克蛋白2 7 ，M A P K 蛋白等等；涉及了肝癌轉(zhuǎn)移的多個(gè)過(guò)程，如代謝，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，為全面、深刻的理解肝癌轉(zhuǎn)移這一復(fù)雜過(guò)程提供了豐富的數(shù)據(jù)。同時(shí)通過(guò)這一工作我們比較了各種分離技術(shù)以及蛋白提取方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)蛋白質(zhì)疏水性不同進(jìn)行的順序提取可以大大增加蛋白的鑒定，而基于雙相凝膠電泳和液相色譜的分離手段則各有優(yōu)勢(shì)，互為補(bǔ)充。基于液相色譜的分離可以避免對(duì)極端分子量和等電點(diǎn)蛋白的歧視，而雙相電泳