正常人肝組織及肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)核心巖藻糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、糖蛋白質(zhì)組學(xué)是研究糖蛋白表達(dá)譜、糖鏈組成及其功能的一門有發(fā)展前景的新學(xué)科。糖蛋白在細(xì)胞識(shí)別、粘附、細(xì)胞間相互作用等細(xì)胞功能中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。許多疾病的發(fā)生與蛋白質(zhì)糖鏈結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。至今仍沒有一個(gè)完整數(shù)據(jù)庫(kù)全面闡述正常生理狀態(tài)下所有糖基化的蛋白質(zhì)，也未見有系統(tǒng)的糖蛋白質(zhì)組學(xué)手段篩查病理過程相關(guān)的異常糖基化蛋白質(zhì)。由于α-1，6巖藻糖(又稱核心巖藻糖)普遍存在于很多糖蛋白中，并且其糖基化程度異常與肝癌或慢性肝病的發(fā)生和診斷關(guān)系密切。本研究利

2、用扁豆凝集素(LCA)對(duì)糖鏈內(nèi)核心巖藻糖的高親和性及適用于大樣本的、高通量糖蛋白質(zhì)組學(xué)共性技術(shù)平臺(tái)，即凝集素親和層析、雙向電泳(2-DE)聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS／MS)分析，首次建立了正常人肝臟組織核心巖藻糖基化蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。同時(shí)應(yīng)用2-DE和凝集素印跡聯(lián)合MALDI-TOF-MS／MS分析，對(duì)高低轉(zhuǎn)移潛能不同人肝癌細(xì)胞系即高轉(zhuǎn)移的MHCC97-H、低轉(zhuǎn)移的MHCC97～L和基本不轉(zhuǎn)移的Hep3B細(xì)

3、胞進(jìn)行研究，獲得了它們的核心巖藻糖基化蛋白質(zhì)修飾譜，發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白I(AnnexinI)、膜聯(lián)蛋白II(AnnexinII)和細(xì)胞角蛋白8(CK8)等異常核心巖藻糖基化狀態(tài)及差異性表達(dá)，分析了此種糖蛋白表達(dá)和糖鏈結(jié)構(gòu)的改變與肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系。 第一部分正常人肝組織核心巖藻糖基化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及生物信息學(xué)分析 本部分研究旨在建立適用于大樣本、相對(duì)穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的高通量糖蛋白質(zhì)組學(xué)共性技術(shù)平臺(tái)，并以此為基礎(chǔ)，建立正常人

4、肝臟組織核心巖藻糖基化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，為正常狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)糖蛋白的全面闡述提供基本生物學(xué)信息，為蛋白質(zhì)核心巖藻糖基化在體內(nèi)功能研究提供理論依據(jù)。 選擇不同正常人的肝臟組織4例，提取總蛋白通過LCA親和層析柱后，分成兩個(gè)組份，柱不結(jié)合組分由非核心巖藻糖基化蛋白構(gòu)成；柱結(jié)合組份由核心巖藻糖基化蛋白組成。兩組份與總蛋白分別進(jìn)行聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)，發(fā)現(xiàn)通過親和層析使得LCA結(jié)合的低豐度糖蛋白得到富集。應(yīng)用非線性pH3～

5、10，長(zhǎng)7cm的固定洲梯度的lPG膠條對(duì)它們進(jìn)行2-DE分離，并結(jié)合蛋白銀染技術(shù)，獲得正常人肝臟組織核心巖藻糖基化蛋白表達(dá)譜，ImageMaster軟件探測(cè)到蛋白質(zhì)點(diǎn)130±3個(gè)，分析圖譜發(fā)現(xiàn)LCA結(jié)合型糖蛋白較偏堿性端，PI7-10，MW26-50KD區(qū)域處有許多高豐度蛋白；同時(shí)從獲得的總蛋白和非核心巖藻糖基化蛋白表達(dá)譜中，分別探測(cè)到蛋白質(zhì)點(diǎn)650±20個(gè)和300±10個(gè)，它們分布情況相似，主要位于PI3-10，MW20～36KDa和

6、PI7-10，MW26～60KDa區(qū)域處。切取正常人肝組織核心巖藻糖蛋白表達(dá)譜中90個(gè)蛋白點(diǎn)，應(yīng)用MALDI-TOF-MS／MS進(jìn)行鑒定，通過數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、分析比對(duì)及去冗余后，共鑒定53種蛋白。將實(shí)際鑒定的53種蛋白利用NetNGlyc1．0和NetoGlyc軟件進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)除6個(gè)蛋白僅具有0-連接糖基化位點(diǎn)外，其他蛋白均含有潛在N-連接糖基化位點(diǎn)，但個(gè)數(shù)不一。按照GeneOntology三種分類方式對(duì)它們分類，細(xì)胞定位分類中

7、位于細(xì)胞器的占LCA結(jié)合型糖蛋白的28％，其中，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為最多；分子功能分類中具有結(jié)合活性和催化活性的蛋白分別占37％和30％；生物學(xué)功能分類中參與體內(nèi)代謝過程的蛋白占33％。 第二部分人肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移相關(guān)的核心巖藻糖基化蛋白質(zhì) 組學(xué)研究 本部分研究旨在建立適用于小樣本，高通量糖蛋白質(zhì)組學(xué)共性技術(shù)平臺(tái)。比較研究轉(zhuǎn)移潛能不同人肝癌細(xì)胞系核心巖藻糖基化蛋白質(zhì)表達(dá)譜，篩查與分析人肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)的異常糖基化

8、蛋白質(zhì)，為肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)及機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)，為疾病相關(guān)分子的糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)手段。 選擇轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移人肝癌組織以及轉(zhuǎn)移潛能不同人肝癌細(xì)胞系Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H，提取總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE和2-DE分離，結(jié)合LCA親和印跡技術(shù)，建立LCA凝集素親和印跡圖譜，即核心巖藻糖基化蛋白表達(dá)圖譜。發(fā)現(xiàn)組織和細(xì)胞內(nèi)蛋白的核心巖藻糖基化程度隨肝癌轉(zhuǎn)移潛能的增加而增加，核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)也

9、相應(yīng)增加。SDS-PAGE／LCA凝集素印跡圖譜顯示，MHCC97-H和MHCC97-L在35～45KDa和45～60KDa間出現(xiàn)了Hep3B未見的條帶。Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H的2-DE／LCA凝集素印跡圖譜中，分別平均檢測(cè)到54±7個(gè)蛋白點(diǎn)(n=3)，59±6個(gè)蛋白點(diǎn)(n=3)，62±4個(gè)蛋白點(diǎn)(n=3)。以各自2-DE-考蘭染色圖譜為參考膠，利用ImageMaster軟件對(duì)各細(xì)胞的核心巖藻糖基化蛋白表達(dá)圖譜和

10、總蛋白2一DE圖譜進(jìn)行匹配分析，Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H分別與其匹配的平均匹配點(diǎn)數(shù)為25±3個(gè)(n=3)，29±4個(gè)(n=3)，26±3個(gè)(n=3)，切取所有匹配蛋白點(diǎn)，應(yīng)用KiLDI-TOF-MS／MS進(jìn)行鑒定，通過數(shù)據(jù)庫(kù)搜索共鑒定34種蛋白。 比較糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AnnexinI、CK8等7種差異分布蛋白質(zhì)的異常核心巖藻糖基化狀態(tài)可能與人肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。并對(duì)AnnexinI，AnnexinI

11、I和CK8異常核心巖藻糖基化再驗(yàn)證，經(jīng)LCA親和沉淀提取的糖蛋白中，AnnexinI在~ff[CC97-H中的表達(dá)水平較MHCC97-L高，而Hep3B中幾乎不表達(dá)；AnnexinII和CK8在MHCC97-L和MHCC97-H中的表達(dá)水平較Hep3B高。表明三種蛋白在高低轉(zhuǎn)移潛能不同人肝癌細(xì)胞中的核心巖藻糖基化程度不同，隨肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的增加而增加。應(yīng)用免疫熒光發(fā)現(xiàn)它們定位在胞漿、Westernblot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析蛋白和

12、mRNA表達(dá)情況，在MHCC97-L和MHCC97-H中它們蛋白含量及mRNA水平相對(duì)較高；應(yīng)用免疫沉淀結(jié)合多種凝集素親和印跡對(duì)AnnexinI和CK8糖鏈結(jié)構(gòu)改變進(jìn)行推斷，AnnexinI在MHCC97-H中對(duì)LCA和刀豆凝集素(ConA)的親和力較強(qiáng)，在Hep3B中幾乎無親和力，同時(shí)蓖麻凝集素(RCA-1)對(duì)兩種細(xì)胞中的AnnexinI都無親和力；CK8在MHCC97-H中對(duì)LCA和RCA-1的親和力較Hep3B高，而ConA對(duì)兩種

13、細(xì)胞中CK8親和力則無明顯差異。 結(jié)論 1.建立了兩種相對(duì)穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的高通量糖蛋白質(zhì)組學(xué)共性技術(shù)平臺(tái)：一種是凝集素層析、2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS／MS分析；另一種是2-DE和凝集素印跡聯(lián)合MALDI-TOF-MS／MS分析。 2．應(yīng)用凝集素層析、2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS／MS分析，建立了正常人肝臟組織核心巖藻糖基化蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，它共有53種蛋白質(zhì)構(gòu)成，主要參與體內(nèi)代謝過程，發(fā)揮催化反應(yīng)和結(jié)合

14、反應(yīng)的作用。 3．應(yīng)用2-DE和凝集素印跡技術(shù)聯(lián)合MALDI-TOF-MS／MS分析建立了不同轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞核心巖藻糖基化蛋白表達(dá)圖譜。Annexin工，AnnexinII和CK8除異常核心巖藻糖基化外，其蛋白表達(dá)水平、RNA水平及糖鏈結(jié)構(gòu)的其他改變也與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。 潛在應(yīng)用價(jià)值 1．凝集素層析、2-DE聯(lián)合MALDI-TOF-MS／MS分析和2-DE、凝集素印跡聯(lián)合MALDI-TOF-Ms／MS分

15、析分別適用于大樣本和小樣本的疾病蛋白質(zhì)組學(xué)中蛋白質(zhì)糖基化修飾譜的研究，對(duì)發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生、發(fā)展中相關(guān)的異常糖基化蛋白質(zhì)有重要價(jià)值。 2．正常人肝組織核心巖藻糖基化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，為機(jī)體正常狀態(tài)下糖蛋白的全面闡述及核心巖藻糖基化功能作用探討提供了基本的生物學(xué)信息。 3．篩檢出的異常核心巖藻糖基化的蛋白質(zhì)，Annexin工，AnnexinII和CK8有可能成為肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的診斷標(biāo)志物及預(yù)后判斷指標(biāo)，以豐富肝癌診療指標(biāo)的選擇

16、與組合。 創(chuàng)新點(diǎn) 1．建立了兩種相對(duì)穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的高通量糖蛋白質(zhì)組學(xué)共性技術(shù)平臺(tái)，為與疾病發(fā)生、發(fā)展中相關(guān)的糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了良好基礎(chǔ)。 2．本研究首次建立正常人肝組織核心巖藻糖基化蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，提出蛋白質(zhì)的核心巖藻糖基化主要參與體內(nèi)代謝過程，發(fā)揮催化反應(yīng)和結(jié)合反應(yīng)的作用。 3．運(yùn)用比較糖蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段從Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H中篩出的7種差異核心巖藻糖基化蛋白質(zhì)中，Annex