正常人肝組織及肝癌相關(guān)WGA親和型糖蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、蛋白質(zhì)糖基化作為一種重要的翻譯后修飾對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，如對蛋白質(zhì)的折疊、運輸、定位和功能表達起著重要的作用。許多疾病的發(fā)生與蛋白質(zhì)糖鏈結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。目前，糖蛋白質(zhì)組學研究熱點主要集中于表達蛋白質(zhì)組學和比較/差異糖蛋白質(zhì)組學。至今沒有一個完整數(shù)據(jù)庫全面闡述正常生理狀態(tài)下所有糖基化的蛋白質(zhì)，也未見有系統(tǒng)的糖蛋白質(zhì)組學手段篩查病理過程相關(guān)的異常糖基化蛋白質(zhì)。肝癌的血清糖蛋白中有許多糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如：唾液酸增多、N-乙酰氨基乳糖重復順序出

2、現(xiàn)、平分型GIcNAc增加等。本研究利用麥胚凝集素(WGA)能夠特異性識別帶有唾液酸的聚糖或帶有平分型GlcNAc、N-乙酰氨基乳糖重復序列的復雜型或雜合型聚糖及相對高通量的糖蛋白質(zhì)組學共性技術(shù)平臺，即凝集素親和層析、雙向電泳(2-DE)膠上熒光顯示聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS/MS)分析，初步建立了正常人肝臟組織W6A親和型糖蛋白表達譜和數(shù)據(jù)庫。同時聯(lián)合應(yīng)用凝集素親和層析、2-DE、復合蛋白質(zhì)組學技術(shù)

3、(Multiplex Proteomics)、MALDI-TOF-MS/MS技術(shù)比較分析正常人肝組織和伴有轉(zhuǎn)移的肝癌組織WGA親和型糖蛋白，獲得了它們的差異表達修飾譜，發(fā)現(xiàn)VCP protein、Prohibitin、Peroxiredoxin 2等WGA親和型差異糖蛋白，驗證了腫瘤組織中VCPprotein糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，且除了唾液酸之外還存在其他導致WGA親和力增強的糖鏈結(jié)構(gòu)。 第一部分：正常人肝組織WGA親和型糖蛋白

4、數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及生物信息學分析。本部分研究旨在建立相對穩(wěn)定、標準的高通量糖蛋白質(zhì)組學共性技術(shù)平臺，并以此為基礎(chǔ)，建立正常人肝臟組織WGA親和型糖蛋白表達譜和數(shù)據(jù)庫，為研究健康人肝組織糖基化修飾譜奠定了基礎(chǔ)，推動了后續(xù)的肝臟疾病比較糖蛋白質(zhì)組學研究。 選擇30例健康人供肝的混合樣本，優(yōu)化組織總蛋白的提取方法，以便更充分地提取組織總蛋白。通過WGA親和層析柱后，獲取WGA親和型糖蛋白，與總蛋白分別進行聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，發(fā)

5、現(xiàn)通過親和層析使得WGA結(jié)合的糖蛋白得到富集，主要集中于47KDa左右。 第二部分肝癌相關(guān)的WlGA親和型糖蛋白比較蛋白質(zhì)組學研究。本部分研究在第一部分建立的糖蛋白表達全譜的技術(shù)平臺上，進一步改進，引入復合蛋白質(zhì)組學(MP)技術(shù)，通過凝集素親和層析和糖蛋白染色雙篩選盡量能夠排除少數(shù)凝集素非特異結(jié)合的蛋白。比較正常人肝組織與伴有轉(zhuǎn)移的肝癌組織WGA親和型糖蛋白的差異，篩查與肝癌相關(guān)的異常糖基化蛋白質(zhì)，旨在篩選肝癌預測、診斷標記物

6、，為差異/比較糖蛋白質(zhì)組學研究提供技術(shù)手段。從30例正常人肝組織混合樣本和30例伴有轉(zhuǎn)移的肝癌組織原發(fā)灶中分別提取總蛋白，層析后，進行WGA親和和印跡、SDS-PAGE以及2-DE比較分析。 結(jié)論：1．建立了兩種結(jié)構(gòu)糖蛋白質(zhì)學技術(shù)平臺：1)凝集素親和層析、2-DE膠上熒光顯示聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS的高通量糖蛋白質(zhì)組學共性技術(shù)平臺；2)聯(lián)合凝集素親和層析、2-DE、MP技術(shù)以及MALDI-TOF-MS/MS技術(shù)的差異

7、糖蛋白質(zhì)組學的高效率技術(shù)平臺。2．應(yīng)用凝集素親和層析、2-DE膠上熒光顯示聯(lián)合MALDI-TOF-MS/MS分析，初步建立正常人肝組織的WGA親和型糖蛋白表達譜和數(shù)據(jù)庫，WGA親和型糖蛋白主要參與體內(nèi)代謝過程，發(fā)揮催化反應(yīng)和結(jié)合反應(yīng)的作用。3．應(yīng)用聯(lián)合凝集素親和層析、2-DE、MP技術(shù)以及MALDI-TOF-MS/MS技術(shù)的差異糖蛋白質(zhì)組學的高效率技術(shù)平臺，建立了正常人肝組織與伴有轉(zhuǎn)移的肝癌組織WGA親和型糖蛋白差異表達譜，鑒定出24種

8、差異糖蛋白。VCP蛋白存在唾液酸化，同時也存在其他可能導致與WGA親和力增強的糖鏈結(jié)構(gòu)。 潛應(yīng)用價值：1．建立的相對穩(wěn)定的高通量糖蛋白質(zhì)組學共性技術(shù)平臺有助于今后疾病相關(guān)的糖蛋白質(zhì)組學研究，對篩選出疾病發(fā)生、發(fā)展中相關(guān)的異常糖基化蛋白質(zhì)有重要價值。2．正常人肝組織的WGA親和型糖蛋白表達譜和數(shù)據(jù)庫的初步建立，為研究健康人肝組織糖基化修飾譜奠定基礎(chǔ)。3．篩選出24種WGA親和型差異糖蛋白，部分糖蛋白有可能成為肝癌診斷及復發(fā)預測的