采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白.pdf

1、背景和目的： 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是原發(fā)于鼻咽粘膜上皮的惡性腫瘤，是我國(guó)發(fā)病率最高的十大惡性腫瘤之一，也是最常見(jiàn)的頭頸部腫瘤。NPC發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)常常已有頸部淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此，鼻咽癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及控制轉(zhuǎn)移是目前鼻咽癌研究的重大課題，同時(shí)為進(jìn)一步揭開(kāi)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有高通量、高靈敏的特點(diǎn)，實(shí)時(shí)、階段表達(dá)蛋白的差異分析，為篩選和鑒定腫瘤生物學(xué)標(biāo)

2、志物提供可靠的技術(shù)。本研究有可能為闡明鼻咽癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及尋找預(yù)測(cè)鼻咽癌轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物提供理論依據(jù)。 方法： 體外培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1(高分化鱗癌細(xì)胞)和CNE2(低分化鱗癌細(xì)胞)，細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，抽取細(xì)胞總蛋白，采用雙向凝膠電泳(2-DE)分離人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2總蛋白，考染顯色，ImageMaster5.0圖像分析系統(tǒng)分析，從膠中選取分離的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-

3、TOF-MS)分析獲取肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，Mascot軟件搜索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定差異蛋白質(zhì)，篩選并初步鑒定出與鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)。而后，把篩選出的差異蛋白質(zhì)丙酮酸激酶作為靶蛋白，利用細(xì)胞免疫組化驗(yàn)證丙酮酸激酶在兩種細(xì)胞株的表達(dá)情況。 結(jié)果： 經(jīng)雙向凝膠電泳分離細(xì)胞總蛋白后，采用質(zhì)譜技術(shù)鑒定和生物信息學(xué)分析得出六個(gè)蛋白，在CNE1細(xì)胞株中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)：丙酮酸激酶、β肌動(dòng)蛋白和20s蛋白酶體。在CNE2細(xì)

4、胞株特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)：腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、蛋白酶β-6亞基和血小板活化因子乙酰水解酶。在上述差異表達(dá)的蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)部分蛋白質(zhì)參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞骨架、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、能量代謝等，提示鼻咽癌轉(zhuǎn)移過(guò)程的發(fā)生是多種蛋白質(zhì)功能共同作用的結(jié)果。再通過(guò)細(xì)胞免疫組化的方法從蛋白水平上驗(yàn)證了丙酮酸激酶，試驗(yàn)結(jié)果顯示：在細(xì)胞株CNE1中呈彌漫性強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在細(xì)胞株CNE2中呈局灶性陽(yáng)性表達(dá)。 結(jié)論： 1.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是快速、有

5、效篩選鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的理想方法。本課題應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)，獲得了分辨率高、重復(fù)性較好的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。 2.人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2具有明顯的差異表達(dá)蛋白質(zhì)圖譜，本研究共分離鑒定出可能與鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的6種差異蛋白，分別是：丙酮酸激酶、β肌動(dòng)蛋白、20s蛋白酶體、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、蛋白酶β-6亞基和血小板活化因子乙酰水解酶。 3.利用細(xì)胞免疫組化的方法對(duì)差異蛋白中的丙酮酸