iTRAQ結(jié)構(gòu)2DLC-MS-MS篩選鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白.pdf

1、目的：應(yīng)用iTRAQ(Isobaric tags for relative and absolutequantification)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2DLC-MS/MS)的方法篩選鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白，分別在基因和蛋白水平對轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白進(jìn)行驗證，從而篩選出預(yù)測鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，為鼻咽癌的浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)，這些分子標(biāo)志物有望在臨床上預(yù)測鼻咽癌患者的預(yù)后及生存率，最終指導(dǎo)鼻咽癌的合理治療。

2、r>　　方法：培養(yǎng)高成瘤不轉(zhuǎn)移的鼻咽癌細(xì)胞株(6-10B)和高成瘤高轉(zhuǎn)移的鼻咽癌細(xì)胞株(5-8F)，分別抽提蛋白質(zhì)，測量蛋白濃度，采用iTRAQ結(jié)合2DLC-MS/MS的方法分離鑒定兩種不同細(xì)胞株的差異表達(dá)蛋白，實驗重復(fù)兩次。通過ProteinPilotTM4.2軟件進(jìn)行Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫搜索及鑒定，從中挑選出符合要求的轉(zhuǎn)移相關(guān)差異蛋白，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。以生物信息學(xué)分析結(jié)果為參考，通過uniprot軟件及相關(guān)文獻(xiàn)檢索分析挑

3、選出23個目的蛋白，采用qRT-PCR(Quantitative Reverse transcriptase Polymerase chain reaction)檢測6-10B和5-8F中目的蛋白mRNA水平的表達(dá)。采用蛋白印跡法(Western Blot)驗證部分蛋白在兩種細(xì)胞中的表達(dá)水平。免疫組織化學(xué)驗證了10例未發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織和20例發(fā)生了頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中部分蛋白的表達(dá)差異，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件

4、進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果：根據(jù)篩選條件，我們共篩選到與鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異蛋白190個。GO分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)(26％)和細(xì)胞核(22％)，涉及的生物學(xué)過程有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、翻譯、代謝、氧化還原反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄、運(yùn)輸、蛋白折疊、細(xì)胞運(yùn)動等。具有的分子功能有蛋白結(jié)合、核苷酸結(jié)合、鈣離子結(jié)合、核糖體結(jié)構(gòu)組成、氧化還原活性等。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白涉及許多癌癥相關(guān)的信號通路，如:細(xì)胞周期、凋亡、MAPK信號通路、p5

5、3信號通路等。構(gòu)建了轉(zhuǎn)移相關(guān)差異蛋白的PPI相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，圖中的核心節(jié)點蛋白主要參與細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞生長、增殖、凋亡和衰老，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，蛋白質(zhì)分解、代謝、運(yùn)輸和糖基化修飾，氧化還原平衡等。qPCR結(jié)果顯示23個目的基因中有11個基因(ADAMTSL4、DIABLO、PDIA4、CALR、SPTBN1、PPIA、GSN、SQSTM1、TXN、RAN、TRIM29)的mRNA表達(dá)請況與iTRAQ的結(jié)果一致，其中ADAMTSL4、DIABL

6、O、PDIA4、CALR、SPTBN1在5-8F中表達(dá)低于6-10B，PPIA、GSN、SQSTM1、TXN、RAN、TRIM29在5-8F中表達(dá)高于6-10B。有3個基因（ANXA5、PTRF、NDRG1）的mRNA的表達(dá)在5-8F和6-10B中沒有統(tǒng)計學(xué)差異，而質(zhì)譜結(jié)果顯示蛋白表達(dá)在5-8F中低于6-10B，另外有9個基因(NPM1、VCP、RDX、PTGES3、MT2A、EIF4EBP1、LGALS3BP、GPX1、AIMP1)的

7、mRNA水平的表達(dá)與質(zhì)譜結(jié)果相反。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)RAN和TRIM29在5-8F中的表達(dá)顯著高于6-10B，ANXA5和SQSTM1在5-8F中的表達(dá)顯著低于6-10B。免疫組織化學(xué)驗證了RAN和TRIM29在發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者組織中表達(dá)顯著高于未轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者組織，ANXA5和SQSTM1的表達(dá)變化則相反。
　　結(jié)論：⑴以鼻咽癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株5-8F和不轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞株6-10B為研究模型，首次采用iTARQ結(jié)

8、合2DLC-MS/MS的方法篩選出了轉(zhuǎn)移相關(guān)差異表達(dá)蛋白共190個，GO功能分析和KEGG通路分析顯示了差異蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能以及涉及的信號通路，為鼻咽癌浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究提供了線索。PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建為鼻咽癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究提供大量的信息和新穎的思路。⑵發(fā)現(xiàn)ADAMTSL4、DIABLO/smac、PDIA4、CALR、SPTBN1在5-8F中較6-10低表達(dá)，PPIA、GSN、SQSTM1、TXN、RAN、TRIM29在5-