iTRAQ結構2DLC-MS-MS篩選鼻咽癌轉移相關蛋白.pdf

1、目的：應用iTRAQ(Isobaric tags for relative and absolutequantification)定量蛋白質組學技術結合二維液相色譜串聯(lián)質譜(2DLC-MS/MS)的方法篩選鼻咽癌轉移相關的蛋白，分別在基因和蛋白水平對轉移相關的蛋白進行驗證，從而篩選出預測鼻咽癌轉移的分子標志物，為鼻咽癌的浸潤轉移機制提供科學的理論基礎，這些分子標志物有望在臨床上預測鼻咽癌患者的預后及生存率，最終指導鼻咽癌的合理治療。

2、r>　　方法：培養(yǎng)高成瘤不轉移的鼻咽癌細胞株(6-10B)和高成瘤高轉移的鼻咽癌細胞株(5-8F)，分別抽提蛋白質，測量蛋白濃度，采用iTRAQ結合2DLC-MS/MS的方法分離鑒定兩種不同細胞株的差異表達蛋白，實驗重復兩次。通過ProteinPilotTM4.2軟件進行Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫搜索及鑒定，從中挑選出符合要求的轉移相關差異蛋白，進行生物信息學分析。以生物信息學分析結果為參考，通過uniprot軟件及相關文獻檢索分析挑

3、選出23個目的蛋白，采用qRT-PCR(Quantitative Reverse transcriptase Polymerase chain reaction)檢測6-10B和5-8F中目的蛋白mRNA水平的表達。采用蛋白印跡法(Western Blot)驗證部分蛋白在兩種細胞中的表達水平。免疫組織化學驗證了10例未發(fā)生頸部淋巴結轉移的鼻咽癌組織和20例發(fā)生了頸部淋巴結轉移的鼻咽癌組織中部分蛋白的表達差異，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件

4、進行數(shù)據(jù)分析。
　　結果：根據(jù)篩選條件，我們共篩選到與鼻咽癌轉移相關的差異蛋白190個。GO分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要定位于細胞質(26％)和細胞核(22％)，涉及的生物學過程有信號轉導、翻譯、代謝、氧化還原反應、轉錄、運輸、蛋白折疊、細胞運動等。具有的分子功能有蛋白結合、核苷酸結合、鈣離子結合、核糖體結構組成、氧化還原活性等。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白涉及許多癌癥相關的信號通路，如:細胞周期、凋亡、MAPK信號通路、p5

5、3信號通路等。構建了轉移相關差異蛋白的PPI相互作用網(wǎng)絡圖，圖中的核心節(jié)點蛋白主要參與細胞周期調控，細胞生長、增殖、凋亡和衰老，信號轉導，蛋白質分解、代謝、運輸和糖基化修飾，氧化還原平衡等。qPCR結果顯示23個目的基因中有11個基因(ADAMTSL4、DIABLO、PDIA4、CALR、SPTBN1、PPIA、GSN、SQSTM1、TXN、RAN、TRIM29)的mRNA表達請況與iTRAQ的結果一致，其中ADAMTSL4、DIABL

6、O、PDIA4、CALR、SPTBN1在5-8F中表達低于6-10B，PPIA、GSN、SQSTM1、TXN、RAN、TRIM29在5-8F中表達高于6-10B。有3個基因（ANXA5、PTRF、NDRG1）的mRNA的表達在5-8F和6-10B中沒有統(tǒng)計學差異，而質譜結果顯示蛋白表達在5-8F中低于6-10B，另外有9個基因(NPM1、VCP、RDX、PTGES3、MT2A、EIF4EBP1、LGALS3BP、GPX1、AIMP1)的

7、mRNA水平的表達與質譜結果相反。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)RAN和TRIM29在5-8F中的表達顯著高于6-10B，ANXA5和SQSTM1在5-8F中的表達顯著低于6-10B。免疫組織化學驗證了RAN和TRIM29在發(fā)生轉移的鼻咽癌患者組織中表達顯著高于未轉移的鼻咽癌患者組織，ANXA5和SQSTM1的表達變化則相反。
　　結論：⑴以鼻咽癌高轉移細胞株5-8F和不轉移鼻咽癌細胞株6-10B為研究模型，首次采用iTARQ結

8、合2DLC-MS/MS的方法篩選出了轉移相關差異表達蛋白共190個，GO功能分析和KEGG通路分析顯示了差異蛋白質的生物學功能以及涉及的信號通路，為鼻咽癌浸潤轉移機制研究提供了線索。PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡圖的構建為鼻咽癌轉移機制的研究提供大量的信息和新穎的思路。⑵發(fā)現(xiàn)ADAMTSL4、DIABLO/smac、PDIA4、CALR、SPTBN1在5-8F中較6-10低表達，PPIA、GSN、SQSTM1、TXN、RAN、TRIM29在5-