鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因fascin-1的功能及機制研究.pdf

1、目的： 本研究擬選取fascin-1基因為研究對象，探索其與鼻咽癌預后的關(guān)系和在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用及其作用機制，為判斷鼻咽癌的預后、預測鼻咽癌轉(zhuǎn)移傾向及基因靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。該研究成果可能直接應用于鼻咽癌發(fā)病、轉(zhuǎn)移等機制的研究、新藥研發(fā)及臨床療效評價等多個方面，將產(chǎn)生良好的社會效益和經(jīng)濟效益。 方法： 1.fascin-1蛋白在人上皮性腫瘤組織中的表達 應用免疫組織化學方法檢測303例人類上皮性腫瘤組

2、織標本及80例相應正常組織標本中fascin-1蛋白的表達，303例上皮性腫瘤包括26例肺癌、33例宮頸癌、22例卵巢癌、38例食管癌、24例胰腺癌、23例胃癌、29例喉癌、17例原發(fā)性肝癌、34例大腸癌、33例乳腺癌、24例鼻咽癌。采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，兩組間比較采用Fisher精確概率法檢驗進行統(tǒng)計分析。 2.fascin-1在鼻咽癌中的表達 采用Westernblot方法檢測fascin-1蛋

3、白在鼻咽癌細胞株中的表達情況。采用免疫組織化學方法檢測194例鼻咽癌組織標本和33例鼻咽慢性炎癥組織fascin-1蛋白的表達。fascin-1表達與臨床病理學參數(shù)統(tǒng)計方法采用非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗；生存分析采用Kaplan-meier統(tǒng)計；fascin-1與鼻咽癌預后的臨床意義采用Coxproportionalhazardsregression統(tǒng)計。 3.fascin-1表達沉默對鼻咽癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響

4、 構(gòu)建特異性干擾fascin-1的慢病毒干擾載體。利用fascin-1慢病毒干擾載體沉默5-8F和CNE1鼻咽癌細胞fascin-1表達，利用Westernblot方法檢測干擾效果。利用MTT體外生長實驗和平板克隆形成實驗評價fascin-1對NPC細胞增殖能力的影響；利用細胞劃痕實驗評價fascin-1對細胞運動能力的影響；利用體外侵襲實驗評價fascin-1對細胞侵襲能力的影響；利用細胞與基質(zhì)相互作用實驗評價在不同的基質(zhì)中fas

5、cin-1對細胞偽足和細胞膜皺褶形成的影響。體外生長實驗采用析因統(tǒng)計方法，平板克隆形成實驗、細胞劃痕實驗及體外侵襲實驗采用2樣本t檢驗。 結(jié)果： 1.fascin-1蛋白在人上皮性腫瘤組織中的表達及其臨床意義 fascin-1在正常組織中，主要表達于血管內(nèi)皮細胞、纖維細胞，因此，在本研究中，我們以fascin-1在血管內(nèi)皮細胞中的表達為實驗的內(nèi)對照。在上皮組織中fascin-1蛋白表達陽性率為6.3％(5/80)

6、，在正常的宮頸、卵巢、胰腺、胃、喉、肝、大腸、乳腺、均低表達或不表達fascin-1。在食管鱗狀上皮細胞，fascin-1蛋白在細胞的基底層低表達，在上層不表達，在鼻咽柱狀上皮，fascin-1蛋白在儲備層低表達，在上層不表達，這提示fascin-1蛋白可能與上皮細胞的分化程度有關(guān)系。 fascin-1蛋白在人類上皮性腫瘤中表達陽性率為59.1％(179/303)。除原發(fā)性肝癌和肺癌外，人類大部分上皮性腫瘤高表達fascin-1

7、蛋白，且明顯強于其相應的正常組織，差異有統(tǒng)計學意義。如fascin-1在90.9％的宮頸癌、81.6％的食管癌、79.3％的喉癌、70.8％的鼻咽癌等腫瘤中均高表達。在胃癌、鼻咽癌組織中，fascin-1蛋白表達在腫瘤的外層染色強于腫瘤的中間部分，這提示fascin-1可能與腫瘤的侵襲有關(guān)系。 2.fascin-1蛋白在人上皮性腫瘤組織中的表達及其臨床意義 在194例鼻咽癌患者中，I期患者為25例(13％)，II期為61

8、例(31％)，III期為50例(26％)，IV期為58例(30％)。194例患者中，72例(37％)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，16例(8％)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移?；颊叩闹形荒挲g為47歲(24～70歲)，其中有90例(46％)患者小于等于45歲，104例(54％)患者大于45歲；149例(77％)患者為男性，45(23％)患者為女性；中位隨訪時間為43.8(1.8～98.8)月，其中30例(15％)患者死亡。 在33例鼻咽慢性炎癥組織中，fasci

9、n-1表達陰性為21例(64％)，弱陽性(+)為6例(18％)，陽性為6例(18％)。在陽性表達的組織中，fascin-1主要表達在基底層。 194例鼻咽癌組織，178例成功進行了IHC檢測，有16例組織標本損壞無法進行IHC檢測。在178例鼻咽癌組織中，154例(86.5％)陽性表達。在鼻咽癌組織中，fascin-1強陽性表達于侵襲的邊緣地區(qū)，而在腫瘤的內(nèi)部呈弱陽性表達。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，晚期鼻咽癌患者(III和IV期)fas

10、cin-1的表達水平高于早期的鼻咽癌患者(I和II期)(P<0.05)。fascin-1表達與鼻咽癌分期(P=0.003)和T分期(P=0.014)相關(guān)，而與患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移不相關(guān)。 Kaplan-Meier生存分析統(tǒng)計結(jié)果顯示，fascin-1表達與鼻咽癌患者存活率呈負相關(guān)(P=0.001)，即fascin-1過表達預示患者預后不良。在fascin-1強陽性(+++)患者中，5年生存率為52％，而陰性、弱

11、陽性(+)及陽性(++)患者5年生存率在78～82％。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移也與鼻咽癌患者的預后相關(guān)，例如N0～2的鼻咽癌患者的5年生存率高于N3的患者(P<0.001)，無遠處轉(zhuǎn)移的患者5年生存率高于發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的患者(P<0.001)。 在115例未發(fā)生轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者(N0和M0)中，我們進一步發(fā)現(xiàn)，fascin-1表達仍然與患者的預后不良相關(guān)(P=0.015)。Cox回歸單因素分析結(jié)果顯示，fascin-1與預后相關(guān)(ha

12、zardsratio(HR)=1.90，P=0.004，95％CI1.23-2.94)，鼻咽癌的分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移也與預后相關(guān)。利用兩因素Cox回歸模型發(fā)現(xiàn)，fascin-1表達是一個獨立的預后因素。利用多因素Cox回歸模型，鼻咽癌的分期和遠處轉(zhuǎn)移是獨立的預后因素，而fascin-1不是獨立的預后因素(P=0.1)，但是，在早期鼻咽癌患者中，fascin-1是一個獨立的預后因素(P=0.043，HR6.06)。

13、3.fascin-1表達沉默對鼻咽癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響 構(gòu)建了3個干擾fascin-1基因表達的慢病毒干擾載體，fascin-1干擾載體＃2和＃3都有明顯的干擾效果，尤其＃3靶點在不同濃度的RNAi實驗中，均能夠穩(wěn)定敲減目的基因。用293FT細胞包裝fascin-1干擾載體＃3和空載體，用慢病毒感染鼻咽癌細胞株5-8F和CNE1細胞，感染后48h檢測干擾效果，Westernblot實驗結(jié)果顯示，fascin-1干擾載體＃3可以有

14、效的沉默鼻咽癌細胞株fascin-1蛋白的表達。 通過MTT法，我們檢測了fascin-1對鼻咽癌細胞體外增殖能力的影響，結(jié)果表明，通過6天的比較，5-8F/mock和5-8F/KD兩組細胞、CNE1/mock和CNE1/KD兩組細胞間增殖能力沒有差異(P>0.05)。平板克隆形成實驗結(jié)果也顯示5-8F/mock和5-8F/KD兩組細胞(t=-0.397，P>0.05)、CNE1/mock和CNE1/KD(t=-0.487，P>

15、0.05)兩組細胞間增殖沒有差異。這些結(jié)果均說明fascin-1對鼻咽癌的細胞體外增殖能力沒有影響。 在細胞劃痕后，5-8F/mock和5-8F/KD細胞在無血清培養(yǎng)的條件下進行劃痕愈合實驗。實驗結(jié)果顯示，5-8F/mock細胞的遷移距離為541.00±52.85μm，5-8F/KD細胞的遷移距離為333.33±46.46μm，5-8F/KD細胞的遷移距離低于對照組，差異具有顯著性(t=5.112，P<0.01)。結(jié)果表明，fa

16、scin-1表達沉默后，細胞的運動能力降低。 腫瘤細胞侵襲24h后，5-8F/mock和5-8F/KD細胞細胞均穿透基底膜向下侵襲，在聚碳酸酯膜上可見腫瘤細胞變形的形態(tài)，5-8F/mock和5-8F/KD細胞侵襲能力是不同，5-8F/mock細胞侵襲數(shù)為88.6±9.2，5-8F/KD細胞侵襲數(shù)為61.4±9.4，差異具有顯著性(t=4.623，P<0.01)，結(jié)果說明fascin-1基因表達沉默后降低了鼻咽癌細胞的侵襲能力。

17、 將5-8F/mock和5-8F/KD細胞培養(yǎng)在不同的細胞外基質(zhì)中，尤其是FN中，5-8F/mock細胞形成了細胞膜皺褶，在CoIV形成絲狀偽足，而在fascin-1表達沉默的5-8F/KD細胞則很少有膜皺褶和絲狀偽足形成。實驗結(jié)果表明，fascin-1表達沉默后抑制細胞膜皺褶和偽足的形成。 結(jié)論： 1.fascin-1在正常上皮中呈低/不表達狀態(tài)，在上皮性腫瘤中，fascin-1明顯表達上調(diào)； 2.在鼻咽