E1A基因?qū)Ρ茄拾┓派湓雒糇饔眉皺C制研究.pdf

1、第一章、E1A基因通過下調(diào)人鼻咽癌細胞血管內(nèi)皮生長因子的表達和提高野生型p53基因的表達來提高放射治療的敏感性
　　 目的：探討腺病毒E1A基因?qū)θ吮茄拾〤NE-2Z細胞放射治療的增敏作用及相關(guān)機制。
　　 方法：選用人鼻咽癌CNE-2Z細胞為靶細胞,分別用PBS,Ad-β-gal,Ad-E1A作用48小時后,用6MVX線分別給與0、2、4、6和8Gy劑量照射后,用MTT法和流式細胞儀檢測三組細胞成活率及細胞周期變化,并

2、進行克隆分析繪制細胞存活曲線,計算放射增敏比來觀察E1A基因?qū)θ吮茄拾〤NE-2Z細胞放射敏感性的影響,同時用RT-PCR法檢測三組細胞的VEGF水平的表達及野生型p53的表達。細胞免疫化學(xué)方法檢測三組細胞的VEGF蛋白的表達。
　　 結(jié)果： RT-PCR結(jié)果顯示Ad-E1A組可以檢測到E1A基因的表達。經(jīng)照射后Ad-E1A組的細胞存活率明顯低于PBS對照組和Ad-β-gal對照組。Ad-E1A組的細胞的生長速度明顯慢于PBS對

3、照組和Ad-β-gal對照組。細胞存活曲線結(jié)果顯示Ad-E1A組的CNE-2Z細胞放射增敏比分別為1.37(D0值比)、1.95(Dq值比)、1.46(SF2比)。PBS對照組和Ad-β-gal對照組的細胞照射后細胞存活曲線分析結(jié)果顯示無差異,D0、Dq、SF2值分別為1.57Gy及1.53Gy、1.82Gy及1.78Gy、0.89及0.82。RT-PCR結(jié)果和細胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示Ad-E1A組比PBS對照組和Ad-β-gal對照組的人

4、鼻咽癌CNE-2Z細胞的VEGF的表達明顯下降,RT-PCR結(jié)果顯示Ad-E1A組比PBS對照組和Ad-β-gal對照組的野生型p53水平明顯上升。流式細胞學(xué)實驗顯示Ad-E1A組+放射治療組細胞的凋亡明顯高于其他組。
　　 結(jié)論： E1A基因通過下調(diào)人鼻咽癌CNE-2Z細胞VEGF的表達和上調(diào)野生型p53的表達來增加人鼻咽癌細胞對放射治療的敏感性。
　　 第二章、E1A基因?qū)θ吮茄拾﹦游锬Ｐ头派湓雒舻膶嶒炑芯?br>　

5、　 目的:探討腺病毒E1A基因?qū)θ吮茄拾﹦游锬Ｐ头派湓雒舻膶嶒炑芯俊?br>　　 方法:取對數(shù)生長期的CNE-2Z細胞5×105/0.2mL,接種于4周齡左右裸鼠右前肢腋部皮下致瘤,第7天裸鼠皮下腫瘤長至直徑0.6～0.8cm時,隨機分為6組(每組10個):PBS組,Ad-β-gal組,放射組,Ad-β-gal+放射組,Ad-E1A組,Ad-E1A+放射組。Ad-β-gal組/Ad-E1A組在第2周開始給予荷瘤裸鼠皮下腫瘤內(nèi)滴度為5

6、×109PFU/50μL的Ad-E1A/Ad-β-gal注射,每周2次,連續(xù)2周,放射組在第3周給予6MV-X照射,每天2Gy,連續(xù)5天。Ad-β-gal+放射組/Ad-E1A+放射組在第2周開始,給予荷瘤裸鼠皮下腫瘤內(nèi)滴度為5×109PFU/50μL的Ad-E1A/Ad-β-gal注射,每周2次,連續(xù)2周,在第3周給予6MV-X照射,每天2Gy,連續(xù)5天。第1次治療后,每隔4天用卡尺測量1次腫瘤的體積,記錄其直徑,裸鼠的生存時間。當腫

7、瘤的直徑超過2cm時,處死裸鼠,分離腫瘤組織,采用免疫組織化學(xué)方法分析VEGF和CD34表達,RT-PCR分析wtp53的表達,Western blot分析VEGF的表達,TUNEL分析細胞凋亡。
　　 結(jié)果:Ad-E1A+放射組較其他組能明顯延緩移植瘤生長時間,Ad-E1A+放射組裸鼠的腫瘤平均體積比單獨放射組小4.7倍,比單獨Ad-E1A組的小5.3倍。Ad-E1A+放射組的裸鼠生存率顯著高于其他治療組。Ad-E1A+放射組

8、的VEGF蛋白表達和微血管密度較其他各組明顯下降。(P＜0.01)。Ad-E1A組和Ad-E1A+放射組的wtp53基因表達明顯上調(diào)。TUNEL分析結(jié)果顯示Ad-E1A組和Ad-E1A+放射組及放射組的腫瘤組織內(nèi)均可明顯觀察到凋亡細胞。并且,Ad-E1A+放射組腫瘤細胞凋亡數(shù)目明顯高于Ad-E1A組或單獨放射組。
　　 結(jié)論:E1A基因通過抑制腫瘤血管的形成和上調(diào)腫瘤組織中wtp53的表達及誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡來提高人鼻咽癌細胞對