放射敏感性腫瘤自殺基因載體對(duì)鼻咽癌殺傷作用的研究.pdf

1、目的:鼻咽癌為鼻咽部常見的惡性腫瘤，發(fā)病年齡較其他惡性腫瘤年齡偏低，多為30～50歲，鼻咽癌發(fā)病率以中國(guó)南方地區(qū)較高。在中國(guó)有資料表明其占全身腫瘤的18～30％，占頭頸部腫瘤的78％。目前鼻咽癌的常規(guī)治療方法主要是放療和化療，本研究擬構(gòu)建一個(gè)新型的具有放射敏感性和腫瘤特異性的鼻咽癌基因治療載體，以期利用雙重協(xié)同殺傷作用以降低放療射線和化療藥物的劑量，提高特異殺傷腫瘤的效果。 方法：采用PCR方法擴(kuò)增早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1(Ear—1

2、)啟動(dòng)子、胞嘧啶脫胺酶(CD)自殺基因、人端粒酶亞基(hTERT)啟動(dòng)子、凋亡抑制因子存活素(Survivin)反義寡核苷酸鏈；通過酶切連接分別構(gòu)建成pEC、pTS、pEC—TS真核表達(dá)載體。采用電轉(zhuǎn)、脂轉(zhuǎn)等方法分別將各基因載體轉(zhuǎn)染CNE一2細(xì)胞，在經(jīng)放射線照射以及前體藥物5一氟胞嘧啶(5一FC)處理后，用RT—PCR檢測(cè)和比較CD、Survivin基因的表達(dá)，并通過高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)前體藥物5一FC轉(zhuǎn)化成瘤內(nèi)毒性藥物5一FU

3、的轉(zhuǎn)化效率；并通過I-toechest33258細(xì)胞核染色觀察實(shí)驗(yàn)處理后的細(xì)胞凋亡情況，同時(shí)通過單核細(xì)胞直接細(xì)胞毒性測(cè)定(MTT)在體外比較上述載體的殺瘤效果。最后通過建立裸鼠動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定相關(guān)對(duì)照，檢測(cè)瘤體經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后的體積變化以及病理特征改變，據(jù)此比較出最具殺瘤效果的載體。 結(jié)果：酶切證實(shí)pEC、pTS、pEC—TS真核表達(dá)載體構(gòu)建成功；并通過轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞I-tDF和CNE一2細(xì)胞，檢測(cè)了}ffER~、啟

4、動(dòng)子在端粒酶陽性細(xì)胞特異性調(diào)控基因表達(dá)的特性；各載體分別轉(zhuǎn)染CNE一2細(xì)胞，在經(jīng)放射線照射和5-FC處理后，用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)用pEC、pEC-TS轉(zhuǎn)染的CNE-2細(xì)胞中CD有效表達(dá)，HPLC檢測(cè)到前體藥物5-FC轉(zhuǎn)化成5-FU；pTS、pEC-TS轉(zhuǎn)染的CNE-2細(xì)胞中則檢測(cè)到Survivin基因表達(dá)明顯降低；pEC-TS實(shí)驗(yàn)組明顯觀察到經(jīng)Hoechest33258染色后出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞；MTT試驗(yàn)結(jié)果也顯示pEC-TS組的殺瘤效

5、果與其他實(shí)驗(yàn)組相比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；裸鼠動(dòng)物模型測(cè)定到pEC-TS組能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，且與其它各組相比較，均有顯著性差異。病理結(jié)果相應(yīng)顯示大量腫瘤細(xì)胞死亡。 結(jié)論：在CNE一2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEC-TS載體后，放射線的照射使Egr-1啟動(dòng)子有效啟動(dòng)了CD基因的表達(dá)，并將5-FC轉(zhuǎn)化成5-FU，同時(shí)hTERT啟動(dòng)子調(diào)控的Survivin反義寡核苷酸鏈特異性降低Survivin基因表達(dá)，提高了CNE-2腫瘤細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性；