鼻咽癌放射敏感性的預測.pdf

1、我國是鼻咽癌發(fā)病率較高的國家之一，放射治療是鼻咽癌的主要治療手段。準確地預測鼻咽癌的放射敏感性，顯得極為重要，但迄今尚未找到預測鼻咽癌放射敏感性的有效指標。 實驗Ⅰ鼻咽癌放射敏感性與癌基因表達程度的相關關系近年來有文獻報道，經癌基因轉染的細胞，其放射敏感性與癌基因表達程度有關。但目前尚未見到異常P53蛋白及bcl-2基因表達程度與鼻咽癌放射敏感性相關關系的研究報道。本實驗采用免疫組織化學染色技術測定鼻咽癌組織中異常P53蛋白及b

2、cl-2基因表達程度，并分析其與鼻咽癌頸淋巴結轉移灶放射敏感性之間的相互關系。 材料與方法: 1.病例： 2000年1月-2002年1月在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院初次接受放射治療的鼻咽癌頸淋巴結轉移病人61例。 2.放射治療：采用直線加速器6MV-x線進行外照射。 3.病灶大小的測量由專人隔日一次用游標卡尺測量頸部最大淋巴結轉移灶的最大徑(a)及其垂直徑(b)，按腫瘤體積計算頸淋巴結轉移灶體積。

3、 4.免疫組織化學染色所有病例的病理切片均行常規(guī)HE染色，及異常P53蛋白、bcl-2基因免疫組織化學染色。免疫組織化學染色方法采用SP法。 5.閱片： 由專人采用雙盲法閱片，計算陽性細胞數(shù)與全部腫瘤細胞數(shù)的比值：將比值為0.1-25％、26-50％、51％-75％，>75％的病例分別定義為-、+、++、+++、++++。 6.統(tǒng)計學處理所有數(shù)據均采用SPSS10.0軟件行統(tǒng)計學處理，用t檢驗比較各組均數(shù)，

4、相關性分析采用Spearman等級相關分析。 結果： 癌基因表達程度與頸淋巴結轉移灶消退情況的相關關系： 以頸淋巴結轉移灶在放射治療過程中體積縮小25％、50％、75％及完全消退所需的放射劑量代表其放射敏感性，即所需的放射劑量越小放射敏感性越高。在Spearman等級相關分析中，異常P53蛋白及bcl-2基因表達程度，與頸淋巴結轉移灶消退過程中所需放射劑量呈正相關(P<0.05)，即與放射敏感性呈負相關關系。

5、 另外，異常P53蛋白含量與bcl-2基因表達程度無相關關系(P>0.05)。 討論： 本實驗分析結果顯示，異常P53蛋白及bcl-2基因表達程度與鼻咽癌頸淋巴結轉移灶的放射敏感性呈負相關關系(P<0.05)，異常P53蛋白表達程度與bcl-2基因表達程度之間無相關關系(P>0.05)。 異常P53蛋白可能是通過以下途徑影響腫瘤的放射敏感性： (1)異常P53蛋白一方面干擾DNA受損傷細胞的G1期抑制

6、，使其繼續(xù)進入S期。 (2)放射治療后當DNA大量損傷時，異常P53蛋白減少受照射后的細胞凋亡。 bcl-2基因可能是通過減少放射所介導的細胞調亡的途徑，來影響腫瘤細胞的放射敏感性。 實驗Ⅱ鼻咽癌放射敏感性與細胞周期蛋白含量的相關關系有研究表明，某些細胞周期蛋白可能與一些腫瘤的預后及其內在的放射敏感性有關。目前臨床上尚未見到有關細胞周期蛋白與鼻咽癌放射敏感性相關關系的研究報道。本實驗采用免疫組織化學染色技術測定鼻

7、咽癌組織中細胞周期蛋白PCNA、Ki-67及Cyclin B1含量，并分析其與鼻咽癌頸淋巴結轉移灶放射敏感性之間的相互關系。 材料與方法： 1.病例同實驗Ⅰ。 2.放射治療同實驗Ⅰ。 3.病灶大小的測量同實驗Ⅰ。 4.免疫組織化學染色所有病例的病理切片均行常規(guī)HE染色，及PCNA、Ki-67及Cyclin B1免疫組織化學染色。免疫組織化學染色方法采用SP法。 5.閱片同實驗Ⅰ。

8、6.統(tǒng)計學處理同實驗Ⅰ。 結果： 細胞周期蛋白含量與頸淋巴結轉移灶消退情況的相關關系： 以頸淋巴結轉移灶在放射治療過程中體積縮小25％、50％、75％及完全消退所需的放射劑量代表其放射敏感性，即所需的放射劑量越小，放射敏感性越高。在Spearman等級相關分析中，細胞周期蛋白PCNA及Ki-67的含量與頸淋巴結轉移灶消退過程中所需放射劑量呈負相關關系(P<0.05)，即與放射敏感性呈正相關關系，而細胞周期蛋白Cy

9、clin B1的含量與頸淋巴結轉移灶消退過程中所需放射劑量無相關性(P>0.05)。 討論： 本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織內PCNA含量不同，其頸淋巴結轉移灶的放射敏感性也明顯不同，二者呈正相關關系。這可能是因為PCNA作為細胞增殖的主要標記物與細胞增殖率明確相關，而細胞增殖率又與腫瘤放射敏感性呈正相關關系。 本研究中細胞周期蛋白Ki-67含量與鼻咽癌頸淋巴結轉移灶的放射敏感性呈正相關關系，符合增殖率高的腫瘤放射敏感性

10、高的規(guī)律。 結論： 本研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織中異常P53蛋白和bcl-2基因表達程度與鼻咽癌頸淋巴結轉移灶的放射敏感性成負相關關系，PCNA和Ki-67蛋白含量與鼻咽癌頸淋巴結轉移灶的放射敏感性成正相關關系，而細胞周期蛋白Cyclin B1含量與其無關。由于頸淋巴結轉移灶與原發(fā)灶病理類型同源，所以異常P53蛋白、bcl-2基因表達程度及PCNA、Ki-67蛋白含量可以預測鼻咽癌的放射敏感性，準確性高于通過腫瘤分化程度來判定其

11、放射敏感性的方法。 近年來發(fā)現(xiàn)，干擾素α不單具有腫瘤細胞毒性作用，還具有誘導腫瘤細胞調亡及調控腫瘤細胞增殖周期的作用。由于腫瘤細胞的放射敏感性與細胞在增殖周期各時相的分布密切相關，干擾素α可能會改變腫瘤細胞的放射敏感性。目前國內外尚未見到干擾素影響鼻咽癌放射敏感性的研究報道。本實驗采用細胞集落形成方法來研究重組人干擾素α-2a對人鼻咽癌細胞系CEN-1放射敏感性的影響。 實驗材料： 1.培養(yǎng)細胞人鼻咽癌細胞系CN

12、E-I。 2.藥物重組人干擾素α-2a(IFNa-2a)。實驗前將藥物用PRMI1640培養(yǎng)液配制成所需的濃度(0.5×103IU/m1，1.0×103IU/ml，1.5×103IU/ml)。 3.主要設備FACS can流式細胞儀。二氧化碳培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，直線加速器。 實驗方法： 1.IFNα-2a對CNE-I細胞放射敏感性的影響： 將培養(yǎng)瓶內對數(shù)生長期的CEN-I細胞胰酶消化，計數(shù)活細胞數(shù)

13、，逐級稀釋后將細胞接種于6cm平皿中。 將其分成四組進行實驗：(1)對照組不做任何處理；(2)單純用藥組分別加入含IFNα-2a 0.5×103IU/ml、10.×103IU/ml及1.5×103IU/ml的培養(yǎng)基5ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，立即除去藥物，繼續(xù)培養(yǎng)14天；(3)單純放射組使用6MVX線分別照射1、3、5、7、9Gy，照射后繼續(xù)培養(yǎng)14天；(4)藥物加放射組不同濃度IFNα-2a作用24小時后進行照射，條件同(2)

14、、(3)。培養(yǎng)14天后計數(shù)細胞集落數(shù)。計算細胞存活率，繪制細胞存活曲線。根據細胞生存曲線計算IFNα-2a在lO％存活率水平時的放射增敏比。 2.IFNα-2a對CNE-I細胞增殖周期的影響： 將培養(yǎng)瓶內對數(shù)生長期的CNE-I細胞胰酶消化。將其分成二組進行實驗：(1)對照組不做任何處理；(2)用藥組加入含IFNα-2a 1.0×lO3IU/nd的培養(yǎng)液5ml，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后立即除去藥物，繼續(xù)培養(yǎng)。分別取對照組和除去藥

15、物后培養(yǎng)0、24、48h用藥組的培養(yǎng)細胞，消化并制成單細胞懸液。 DNA含量的檢測：常規(guī)方法用流式細胞儀檢測CNE-I細胞內DNA含量，推算出細胞增殖周期中各時相細胞的分布。 結果： 1.IFNα-2a對CNE-I細胞放射敏感性的影響由細胞相對存活曲線可以測出在10％細胞存活水平時，0.5×103IU/Hd、1.0×103IU/ml、1.5×103IU/ml IFNα-2a作用24小時后的SER 分別為1.16、

16、1.61、1.85。 2.IFNα-2a對CNE-I細胞增殖周期的影響IFNα-2a作用于CNE-I細胞后24h，CNE-I細胞周期時間(46.6h)較對照組(38.8h)延長(P<0.05)，其中G1期時相(23.3h)延長和S期時相(4.2h)縮短與對照組(17.6h和6.9h)相比均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IFNo：-2a作用于CNE-I細胞后0、48h，CNE-I細胞周期各時相變化與對照組相比均不明顯(P>0.05

17、)。 討論： 本實驗發(fā)現(xiàn)，1.0×103IU/ml IFNα-2a作用后24h，CNE-I細胞增殖周期S期時間較對照組縮短，有統(tǒng)計學意義。 實驗還發(fā)現(xiàn)隨著IFNα-2a濃度的增大，人鼻咽癌細胞CNE-I放射后的生存曲線形狀發(fā)生變化，直線部分的斜率增大，說明IFNα2a具有一定的放射增敏效應，且IFNα-2a放射增敏效應呈濃度依賴性。這可能與IFNα作用于CNE-I細胞后，誘導細胞增殖周期S期縮短，使處于放射抵抗的