ShRNA-hIAP2增強(qiáng)CNE-1鼻咽癌細(xì)胞對放射敏感性的實驗研究.pdf

1、鼻咽癌作為中國地域常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)病起于鼻咽粘膜被覆上皮，自然生存時間平均為18.7個月，起病隱蔽，早期不易被發(fā)現(xiàn)。發(fā)病者多分布于我國兩廣地區(qū)、沿海省份福建、中南地區(qū)如湖南等，從性別上來看，女性發(fā)病率小于男性。從發(fā)病年齡上來看，以中年人為主。從種族易感性上來看，白種人發(fā)病率小于黃種人，從病因上來看，其發(fā)病與人類皰疹病毒感染和某些遺傳因素等有關(guān)系。目前，治療手段以放射治療為主。從已有的國內(nèi)外報道可知，鼻咽癌放射治療后5年生存率為6

2、0％左右。隨著放射治療設(shè)備更新，放射治療技術(shù)改進(jìn)，鼻咽癌放射治療后的5年生存率不斷提高。上海某腫瘤醫(yī)院報告，1955年以前應(yīng)用深度X線治療，5年生存率為8％，1983年5年生存率為54％。鼻咽癌放療后的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是病人死亡的主要原因，復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是鼻咽癌多種生物效應(yīng)的結(jié)果，因此除了要改進(jìn)放療技術(shù)，提高放療效果外，還要對鼻咽癌的生物學(xué)特性，鼻咽癌病人機(jī)體方面的因素以及腫瘤與病人機(jī)體相互作用等因素進(jìn)行研究。根據(jù)病人機(jī)體鼻咽癌的生物學(xué)特

3、性，在治療上從放療、化療、免疫治療、基因治療、中醫(yī)中藥和其他治療方法上綜合考慮，選擇和制定適宜的治療方案，以進(jìn)一步提高療效。本研究以鼻咽癌細(xì)胞系CNE1為研究對象，構(gòu)建shRNA-hIAP2，采用RNA干擾為手段，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，研究hIAP2對增強(qiáng)CNE1細(xì)胞株對于放射敏感性的影響，初步探討其作用機(jī)制，為臨床基因輔助治療打下一定基礎(chǔ)。
　　目的:構(gòu)建凋亡抑制蛋白(hIAP-2)的shRNA，靶向抑制hIAP-2基因聯(lián)合

4、放療，探討其對CNE1鼻咽癌細(xì)胞株放射敏感性的影響。
　　方法:首先采用MTT法確定最佳放射劑量;再構(gòu)建四條hIAP-2-shRNA沉默片段并用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞，最后采用實時熒光定量PCR(Q-PCR)和免疫印跡法(WB，Western blot)篩選出最佳沉默shRNA序列;用最佳沉默shRNA序列轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞，分別設(shè)置轉(zhuǎn)染放射線照射組與未轉(zhuǎn)染放射線照射組，采用實時定量PCR和WB檢測hIAP-2的基因及蛋白表達(dá)，采

5、用ICC檢測hIAP-2在CNE1細(xì)胞中的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞凋亡，transwell測細(xì)胞侵襲能力。
　　結(jié)果:MTT法確定4Gy為最佳放射劑量;Q-PCR和WB檢測結(jié)果顯示四條hIAP-2-shRNA均能有效抑制hIAP-2 mRNA及蛋白表達(dá)(P＜0.05)，以hIAP-2-shRNA2沉默效果最顯著(P＜0.05);Q-PCR、WB及ICC檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染hIAP-2-shRNA2后照射組與未轉(zhuǎn)染hIAP-2-shRNA

6、2照射組的CNE1細(xì)胞中hIAP-2基因與蛋白表達(dá)有顯著差異(P＜0.05);流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染hIAP-2-shRNA2后照射組比未轉(zhuǎn)染hIAP-2-shRNA2照射組凋亡率有顯著差異(P＜0.05);transwell檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染hIAP-2-shRNA2后照射組與未轉(zhuǎn)染hIAP-2-shRNA2照射組侵襲能力有顯著差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:轉(zhuǎn)染hIAP-2基因沉默后放射可增加鼻咽癌細(xì)胞凋亡率，降低其侵襲能