酪氨酸激酶Etk-BMX對鼻咽癌放射敏感性影響的研究.pdf

1、一、背景: 鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)是中國南部高發(fā)腫瘤，其發(fā)病有明顯的種族地區(qū)和家族地區(qū)聚積現(xiàn)象。據(jù)估計世界上80％的鼻咽癌發(fā)生于我國，其中絕大部分又分布于廣東及周邊地區(qū)。鼻咽癌是耳鼻咽喉科最常見的惡性腫瘤，占頭頸部惡性腫瘤的78.08％。其發(fā)病年齡較其他癌癥年輕，以30～50歲為最多。男性較女性多發(fā)，患者男女之比為3:1。早期鼻咽癌的治愈率可達(dá)70％左右，而晚期患者的5年生存率僅8％～1

2、0％。鼻咽癌已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國人民生命和健康的十大惡性腫瘤之一。 鼻咽癌多屬低分化鱗狀細(xì)胞癌，其重要治療手段是放療。部分鼻咽癌患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，其主要原因是癌細(xì)胞對放射線產(chǎn)生抵抗性，具體機(jī)制目前尚不十分清楚。影響腫瘤細(xì)胞放射敏感性的因素很多，細(xì)胞凋亡是重要的因素之一。自1972年Kerr發(fā)現(xiàn)自然界存在凋亡現(xiàn)象以來，人們對其認(rèn)識不斷加深，并陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了凋亡抑制基因bcl-2和凋亡活化基因p53等一系列凋亡調(diào)控基因，同時發(fā)現(xiàn)這些基因

3、亦可以參與調(diào)控細(xì)胞周期的改變。 內(nèi)皮/上皮細(xì)胞酪氨酸激酶(Theendothelial/epithelialtyrosinekinase，Etk/BMX)，屬于蛋白酪氨酸激酶(Bruton'styrosinekinase，Btk)家族。Etk是其中唯一一種不僅分布于淋巴造血細(xì)胞，還在上皮性瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的非受體類酪氨酸激酶。國外學(xué)者最早在前列腺癌和乳腺癌中研究發(fā)現(xiàn)：野生型Etk高表達(dá)可以明顯抑制癌細(xì)胞凋亡。而在鼻咽癌

4、中研究顯示Etk在鼻咽癌細(xì)胞中出現(xiàn)異常高表達(dá)。本次實驗旨在利用Etk/BMX穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株(sune-wt)，從體外和體內(nèi)兩個方面研究Etk/BMX對鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的影響，為探討鼻咽癌放射抵抗的機(jī)制提供實驗依據(jù)。 二、目的: 研究酪氨酸激酶Etk/BMX對鼻咽癌細(xì)胞放射敏感性的影響并探討其可能機(jī)制。 三、方法: 選取鼻咽癌細(xì)胞株中表達(dá)Etk最低的sune-1作為細(xì)胞本株，利用Lipofectami

5、ne2000將野生型酪氨酸激酶：Etk/BMX表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-Etk導(dǎo)入其中，經(jīng)過篩選擴(kuò)大培養(yǎng)成功建立Etk/BMX穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株sune-wt，同時導(dǎo)入空質(zhì)粒pcDNA3.0轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照(sune-vector)。X射線(0、2、4、10、15Gy)照射后，MTT法測定細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)(survivalfraction，SF)；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率、細(xì)胞周期、增殖指數(shù)以及凋亡相關(guān)蛋白p53、bcl-2、bcl-x1

6、和bak的變化情況。將上述3組細(xì)胞皮下接種于BALB/Cnu/nu裸鼠，觀察其成瘤情況并計算腫瘤體積，腫瘤體積使用游標(biāo)卡尺測量腫塊的長半徑R1和短半徑R2。計算公式為：V=4/3×π×R1×R1×R2。當(dāng)成瘤到一定時間(21天)時對其進(jìn)行X線照射(5Gy)×5天。觀察其腫瘤變化情況。采用SPSS10.0針對存活分?jǐn)?shù)、凋亡率、細(xì)胞周期、增殖指數(shù)、p53、bcl-2、bcl-xl和bak等進(jìn)行析因分析，動物實驗采用重復(fù)測量設(shè)計、LSD兩兩比

7、較等。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。 四、結(jié)果: 1、成功篩選出高Etk表達(dá)的細(xì)胞株：利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞株sune-1和sune-wt進(jìn)行檢測。sung-1表達(dá)率為4.6±1.45％；sune-wt表達(dá)率為75.5±2.34％。 2、sune-wt組SF均顯著高于對照組：不同劑量X線照射后sune-wt組SF均高于sune-1、sune-vector，而sune-1、sune-vector之間無顯著差異。

8、 3、sune-wt凋亡率均較對照組低：不同劑量照射后sune-wt凋亡率均比陰性對照和空白對照組低。0、4、10和15Gy照射后細(xì)胞凋亡均隨著照射劑量的增加而增加，在同一劑量時sune-wt均較其他細(xì)胞株不敏感，凋亡率低，而sane-1和sune-vector之間無明顯差異。 4、sune-wt照射組較sune-wt未照射組p53減少、bcl-2增加，bcl-x1、bak無明顯變化，而sune-1、sune-vector照射前

9、后p53、bcl-2、bak無統(tǒng)計學(xué)差異。 5、0，4，10Gy照射后三者細(xì)胞周期無統(tǒng)計學(xué)改變，15Gy照射后sune-wt出現(xiàn)明顯S、G2期阻滯，G1期減少。照射后增殖指數(shù)均較照射前提高，sune-wt的增幅更加顯著。 6、皮下接種細(xì)胞成瘤結(jié)果示：sune-wt接種一次成功率87.5％，sune-1為50％，sune-vector為40％。sune-wt較sune-vector和sune-1成瘤率較高，X射線照射后體積