放射線誘導(dǎo)自殺基因在鼻咽癌的靶向表達(dá)研究.pdf

1、目的：通過(guò)克隆人Egr-l啟動(dòng)子，構(gòu)建由Egr-l啟動(dòng)子調(diào)控，含Egr-1-CD基因的重組真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)Egr-1-CD并轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞系(C№)，達(dá)到放射線誘導(dǎo)CD／5-Fc自殺基因系統(tǒng)在鼻咽癌細(xì)胞中靶向表達(dá)，觀察基因表達(dá)與放射的劑量效應(yīng)關(guān)系，建立腫瘤基因——放射治療系統(tǒng)，通過(guò)放射線和基因的雙重作用殺傷腫瘤，提高放射增敏比，降低放療劑量，減少正常組織損傷。 方法：根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的人Egr-l啟

2、動(dòng)子基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，采用PCR方法，從人肝組織DNA中擴(kuò)增出Egr-l基因片斷，與pcDNA3．1(+)一CD定向連接，構(gòu)建受控于Egr-1啟動(dòng)子的pcDNA3．1(+)一CD真核表達(dá)載體pcDN^3．1(+)Egr-1-CD，用限制性內(nèi)切酶，PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序的方法鑒定真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)Egr-1-CD構(gòu)建成功，并利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細(xì)胞株，經(jīng)G418篩選后獲得表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞克隆，RT

3、-PCR分析鑒定轉(zhuǎn)染成功。用不同劑量的X線照射表達(dá)陽(yáng)性的鼻咽癌細(xì)胞，觀察基因表達(dá)與放射的劑量效應(yīng)關(guān)系，進(jìn)一步體外分組觀察不同的放射線誘導(dǎo)CD／5-Fc自殺基因系統(tǒng)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，gFr方法檢測(cè)細(xì)胞存活比率，通過(guò)繪制不同組鼻咽癌細(xì)胞存活曲線，觀察放射增敏作用。 結(jié)果：成功克隆了人Egr-l啟動(dòng)子，構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)Egr-1-CD，經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶，PCR和DNA測(cè)序證實(shí)了其正確性，CD基因轉(zhuǎn)染CNE

4、細(xì)胞后，經(jīng)G418篩選后獲得陽(yáng)性克隆株Egr-1-CD—CNE，經(jīng)RT-PCR分析CD基因已轉(zhuǎn)入CNE細(xì)胞并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。電離輻射可誘導(dǎo)增強(qiáng)自殺基因陽(yáng)性細(xì)胞株中CD基因的表達(dá)，電離輻射與前藥5-Fc的聯(lián)合應(yīng)用大大增強(qiáng)了對(duì)自殺基因陽(yáng)性CNE細(xì)胞的殺傷作用，其殺傷作用大于單獨(dú)自殺基因前藥系統(tǒng)和單獨(dú)照射。 結(jié)論：真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)Egr-1-CD構(gòu)建及轉(zhuǎn)染CNE細(xì)胞成功，建立了基因表達(dá)與放射的劑量效應(yīng)關(guān)系，放射線誘導(dǎo)Egr