miR-10b在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的功能和調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的: 鼻咽癌是中國(guó)南方和東南亞地區(qū)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，以明顯的區(qū)域分布特征、與EB病毒的密切關(guān)系以及強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)移傾向顯著區(qū)別于其他頭頸部腫瘤。轉(zhuǎn)移是鼻咽癌治療失敗的主要原因，盡管診療技術(shù)不斷進(jìn)步，但由于60-85%的患者確診時(shí)已發(fā)生臨床轉(zhuǎn)移，鼻咽癌的5年生存率提升緩慢，探究鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，減少轉(zhuǎn)移的發(fā)生，是我們面臨的巨大挑戰(zhàn)。 LMP-1是鼻咽癌最重要的外源性癌基因，也是鼻咽癌最重要

2、的促轉(zhuǎn)移基因。在鼻咽癌中，LMP-1發(fā)揮類(lèi)似腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）的功能，通過(guò)激活NF-κB，AP-1，ets-1，MAPKs，JAK/STAT，P13K/Akt等不同信號(hào)通路，對(duì)E-cadherin，MMPs，c-Met，VEGF，EGFR，COX-2等多個(gè)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的調(diào)控，影響著鼻咽癌轉(zhuǎn)移的幾乎每個(gè)環(huán)節(jié)。沉默LMP-1能夠減少鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。 miRNA

3、（microRNA）是廣泛存在于生物體內(nèi)的19-25nt的非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄完成后，miRNA與靶mRNA的3'UTR的互補(bǔ)序列結(jié)合，通過(guò)抑制mRNA的翻譯或直接降解mRNA調(diào)控基因表達(dá)。人類(lèi)基因組編碼的miRNA多達(dá)1000個(gè)，參加了包括胚胎形成、發(fā)育、代謝和重大疾病在內(nèi)的幾乎所有生命活動(dòng)。一些miRNA能夠影響細(xì)胞凋亡、增殖與分化，扮演著癌基因的角色，被稱(chēng)為oncomirs。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)及其復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包括上皮細(xì)胞去極化，細(xì)

4、胞間黏附改變，運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)，基底膜穿透，血管生成等一系列變化，涉及了大量信號(hào)通路激活和多個(gè)基因的表達(dá)變化。這一過(guò)程同樣離不開(kāi)miRNA對(duì)基因表達(dá)的精準(zhǔn)調(diào)控。我們對(duì)oncomirs在腫瘤轉(zhuǎn)移中的功能和作用機(jī)制還知之甚少，最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92家族，miR-200家族，miR-205，miR-29C，miR-21，Let-7等oncomirs在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，也發(fā)揮著重要作用。 miR-10b促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)更是備受矚

5、目。Ma和同事等發(fā)現(xiàn)miR-10b僅在高轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)，阻斷miR-10b能夠使MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力下降90%以上，而不具備轉(zhuǎn)移能力的SUM149細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-10b后，在裸鼠體內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。臨床資料也表明，發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，miR-10b表達(dá)高于非轉(zhuǎn)移組。這一研究還發(fā)現(xiàn)。乳腺癌細(xì)胞中miR-10b的表達(dá)，正是由轉(zhuǎn)錄因子Twist啟動(dòng)的。 Twist屬于堿性的螺旋-環(huán)-螺旋（Helix-loop-

6、helix）蛋白家族中高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過(guò)程中的組織重建，并賦予細(xì)胞遷移的能力，也是促進(jìn)多種腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲的關(guān)鍵基因，在鼻咽癌的轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮重要作用。Horikawa T.等發(fā)現(xiàn)LMP-1能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Twist，促進(jìn)鼻咽癌轉(zhuǎn)移和侵襲。據(jù)此我們提出研究假說(shuō)：miR-10b受LMP-1/Twist信號(hào)通路調(diào)控，在鼻咽癌進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)轉(zhuǎn)移的功能。 為了證實(shí)這一假說(shuō)，我們首先檢測(cè)miR-10b在鼻咽癌組織和不

7、同的鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，分析miR-10b表達(dá)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，并觀察LMP-1和Twist的表達(dá)變化對(duì)miR-10b的影響。利用pre-miR-10b慢病毒表達(dá)載體，在鼻咽癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-10b，或轉(zhuǎn)染miR-10b抑制劑阻斷miR-10b，分析其表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞周期、增殖、凋亡，移動(dòng)、侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響，以初步探討鼻咽癌轉(zhuǎn)移中miR-10b的功能和作用機(jī)制。 方法: 1.鼻咽癌組織和細(xì)胞中miR-1

8、0b的檢測(cè) 收集鼻咽癌組織標(biāo)本45例（其中轉(zhuǎn)移26例，未轉(zhuǎn)移19例），慢性鼻咽炎組織16例作對(duì)照。所有新鮮鼻咽癌組織標(biāo)本分為2份，一份經(jīng)10%甲醛固定，包埋、切片免疫組化染色檢測(cè)LMP-1表達(dá)情況。另一份標(biāo)本液氮凍存，制作冰凍切片，用原位雜交檢測(cè)miR-10b表達(dá)。 2.鼻咽癌細(xì)胞中miR-10b的檢測(cè) 長(zhǎng)期攜帶EB病毒基因的人類(lèi)低分化鼻咽癌細(xì)胞株C666-1，高分化鼻咽癌細(xì)胞CNE1，低分化鼻咽癌細(xì)胞CNE2、

9、HONE1、HNE-1細(xì)胞，以及SUNE-1細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移亞株5-8F和不轉(zhuǎn)移亞株6-10B，永生化鼻咽上皮細(xì)胞株NP69細(xì)胞，8株細(xì)胞分別采用熒光定量PCR和原位雜交檢測(cè)miR-10b表達(dá)。 3.沉默及過(guò)表達(dá)LMP-1表達(dá) 合成能夠轉(zhuǎn)錄出LMP-1干擾模板的雙鏈DNA片段，插入shRNA的表達(dá)載體pAVU6+27，獲得pAVU6+27/shLMP-1質(zhì)粒。以空pAVU6+27載體為對(duì)照，分別轉(zhuǎn)染C666-1細(xì)胞后，通過(guò)G

10、418篩選和巢式PCR檢測(cè)獲得LMP-1陰性的亞株C666/shLMP-1。含有N-LMP-1 cDNA的質(zhì)粒pCR（）Ⅱ-TOPO/LMP-1，用Lipofectamine-2000轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48h后RT-PCR檢測(cè)LMP-1mRNA水平。 4.miRNA提取和Real time PCR檢測(cè) 按照mirVana miRNA isolation kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，富集分子量小于200nt的小分子RNA。按照TaqMa

11、n MicRNA RT Kit說(shuō)明書(shū)操作，采用TaqMan MicRNA Assays中的逆轉(zhuǎn)錄引物，以cDNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，U6 RNA作為內(nèi)對(duì)照。 5.制備慢病毒載體穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-10b 根據(jù)miR-10b前體pre-mir-10b（MI000681）的序列，在5’端和3’端引入MluⅠ和ClaⅠ的酶切位點(diǎn)，合成全長(zhǎng)102bp的pre-mir-10b轉(zhuǎn)錄模板，連接轉(zhuǎn)化，挑取重組陽(yáng)性克隆，經(jīng)PCR、Mlu

12、Ⅰ和XbaⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送DNA測(cè)序。采用脂質(zhì)體法將慢病毒包裝系統(tǒng)中3種質(zhì)粒按比例共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收集上清液，離心過(guò)濾后，得到慢病毒懸液。病毒懸液連續(xù)稀釋法計(jì)算病毒滴度。慢病毒pLVTHM/miR-10b和空病毒載體pLVTHM感染鼻咽癌細(xì)胞。采用流式細(xì)胞儀分選出GFP（+）細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。Real PCR檢測(cè)miR-10b表達(dá)水平。 6.siRNA及anti-miR轉(zhuǎn)染 細(xì)胞融合度達(dá)到40%左右，更換

13、無(wú)血清培養(yǎng)基。將anti-miR充分溶解于不含有血清的轉(zhuǎn)染專(zhuān)用培養(yǎng)基Opti-MEM中。陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000用Opti-MEM稀釋后，與siRNA或anti-miR溶液混合，輕輕振蕩后，置于室溫20min，加入細(xì)胞培養(yǎng)板。37℃孵育4h后，加入30%胎牛血清FBS，繼續(xù)培養(yǎng)24h，48h，72h后，熒光定量PCR方法檢測(cè)miR-10b表達(dá)水平的變化。 7.miR-10b報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建和雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)

14、 以基因組DNA為模板擴(kuò)增出將含有miR-10b種子區(qū)互補(bǔ)序列的片段作為miR-10b結(jié)合位點(diǎn)，將片段插入psiCHECK-2質(zhì)粒海腎熒光素Renilla下游XhoⅠ和NotⅠ位點(diǎn)之間。用Lipofectamine-2000將psiCHECK-2/miR-10b-binding質(zhì)粒anti-miR，同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24h后按照Dual-Luciferase Reporter Assay System的說(shuō)明進(jìn)行樣品的Lucifera

15、se活性檢測(cè)，根據(jù)熒光素比值：Luciferase activity（Renilla/Firefly）變化分析miRNA inhibitor抑制miR-10b的效果。 8.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞以每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μl，每組5孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（僅加培養(yǎng)基），分別培養(yǎng)1-5天。每孔加入5mg/ml的MTT20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，加入DMSO，酶標(biāo)儀上570nm測(cè)定各孔吸光

16、度值（OD值），以相對(duì)應(yīng)OD比值表示細(xì)胞增殖能力大小。各組取5孔平均值，繪制增殖曲線。 9.流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn) C666/shLMP-1和C666/shLMP-1/miR-10b細(xì)胞，0.25%胰酶消化，PBS洗滌3次后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml的細(xì)胞懸液，離心后，按照BD公司熒光染色試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行熒光標(biāo)記，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。 10.劃痕實(shí)驗(yàn) 在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組細(xì)胞作3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞密

17、度達(dá)到90%左右，吸干培養(yǎng)基，用同樣大小的加樣槍頭，垂直在培養(yǎng)孔中部輕輕劃過(guò)，制造多條相互平行的劃痕，力度以刮落細(xì)胞而不在培養(yǎng)板上留痕為準(zhǔn)。培養(yǎng)液沖去脫落細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)。每個(gè)孔隨即選取9個(gè)有劃痕穿過(guò)的視野，在不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)越過(guò)劃痕邊緣向空白出移動(dòng)生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 11.侵襲實(shí)驗(yàn) 12.體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn) 13.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)論： 1.miR-10b在轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，