miR-10b調(diào)控HOXD10在食管癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的研究.pdf

1、目的:通過檢測miR-10b及其潛在靶基因HOXD10在食管癌細胞及組織中的表達，在細胞中進行基因轉(zhuǎn)染及敲除，檢測轉(zhuǎn)染前后細胞的核酸和蛋白表達變化以及侵襲遷移能力的改變情況，探討二者的調(diào)控關(guān)系及在食管癌中侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。
　　方法:通過熒光定量 PCR技術(shù)及蛋白免疫印跡技術(shù)驗證30對食管癌組織及癌旁組織和食管癌細胞系KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、EC9706、食管永生化上皮SHEE及其癌變細胞系SH

2、EEC中miR-10b的表達，分析其表達與臨床病理特征的關(guān)系，對患者進行電話隨訪并分析 miR-10b對患者生存預(yù)后的影響。利用生物信息軟件預(yù)測到下游靶基因為 HOXD10，驗證 HOXD10在食管組織和細胞上的表達，并用慢病毒表達載體對 miR-10b低表達食管癌細胞株KYSE30、KYSE140進行過表達轉(zhuǎn)染及對 miR-10b高表達食管癌細胞株 EC9706進行敲除，用 RT-PCR和 Western Blot方法檢測 HOXD1

3、0的表達改變的情況，闡明miR-10b對HOXD10調(diào)控關(guān)系，通過Wound healing實驗和Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染及抑制前后細胞株的侵襲、遷移能力，并檢測促轉(zhuǎn)移因子 MMP-9的表達情況，探明miR-10b調(diào)控HOXD10基因在食管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.食管癌細胞和組織中 miR-10b的表達：食管癌細胞系中， KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150細胞系上miR-10b

4、表達較低，EC9706表達較高，人食管永生化上皮 SHEE較其癌變細胞系 SHEEC表達低；在組織中，食管癌組織較對應(yīng)食管癌旁正常組織 miR-10b表達較高，在癌中淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移組 miR-10b較未發(fā)生轉(zhuǎn)移高，與年齡、性別、腫瘤大小、分化程度無關(guān)；miR-10b高表達組與低表達組對生存期的影響無明顯差異。
　　2.食管癌細胞和組織中 HOXD10的表達：在食管癌細胞系中， HOXD10 mRNA的表達在 KYSE30、KYSE

5、70、KYSE140中表達較高，其余較低， HOXD10蛋白水平表達最高的是 KYSE140，最低的是 KYSE150；在食管組織中，食管癌組織 HOXD10 mRNA水平較對應(yīng)食管癌旁正常組織較低，蛋白水平同樣癌組織低于癌旁組織。
　　3. miR-10b調(diào)控 HOXD10基因的表達：生物信息學(xué)軟件預(yù)測提示， HOXD10可能是 miR-10b靶基因之一，在不同細胞系用慢病毒載體過表達或抑制 miR-10b，HOXD10蛋白表達

6、下調(diào)或上調(diào)，對 HOXD10 mRNA水平無明顯影響。
　　4. miR-10b促進食管癌細胞的遷移和侵襲：劃痕實驗和細胞遷移侵襲實驗中， miR-10b在細胞系過表達和抑制前后，細胞的遷移、侵襲能力隨著 miR-10b表達上調(diào)或下調(diào)而增加或降低。敲除HOXD10之后，也可以促進細胞的遷移和侵襲，效果類似miR-10b過表達。
　　5. HOXD10可負(fù)調(diào)控促轉(zhuǎn)移因子 MMP-9影響食管癌侵襲轉(zhuǎn)移：細胞系中HOXD10基因抑