鼻咽癌中hsa-miR-26a功能的初步研究.pdf

1、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)是我國南方及東南亞地區(qū)常見的一種惡性腫瘤，尤以廣東省珠江三角洲一帶多見，故有“廣東瘤”之稱。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多步驟遺傳變異積累的復(fù)雜過程，與愛波斯坦.巴爾病毒(EpsteinBarrVirus，EBV)感染、化學(xué)促癌物和/或致癌物以及遺傳因素密切相關(guān)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌發(fā)病具有民族、地域和家族聚集現(xiàn)象，遺傳易感因素如3p、9p和14q等染色體的等

2、位基因雜合子缺失(Iossofheterozygosity，LOH)與鼻咽癌發(fā)生密切相關(guān)，說明該惡性腫瘤是一種涉及多個(gè)基因改變的遺傳性疾病。但迄今為止，鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全闡明。 多項(xiàng)研究結(jié)果表明，鼻咽癌患者在3號(hào)染色體短臂最常發(fā)生連續(xù)性、非隨機(jī)性LOH，其中3p14-21(FHIT)、3p21.3-22和3p25-26(VHL)是原發(fā)性鼻咽癌LOH高頻區(qū)，且3號(hào)染色體短臂的遺傳學(xué)改變常發(fā)生在鼻咽部上皮細(xì)胞表型發(fā)生異常和

3、EBV感染之前，是鼻咽癌發(fā)生過程中的極早期事件。因此，在3號(hào)染色體短臂尋找鼻咽癌相關(guān)的未知基因?qū)τ诮沂颈茄拾┌┳冊(cè)缙诘姆肿訖C(jī)制具有重要的意義。 MicroRNA(miRNA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)約19-25個(gè)核苷酸(nucleotide，nt)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，與動(dòng)植物的組織器官發(fā)育、細(xì)胞分化和凋亡、胰島素分泌、脂肪代謝等生命活動(dòng)密切相關(guān)，其表達(dá)異常將導(dǎo)致重大疾病，例如腫瘤的發(fā)生。研究表明，

4、50％以上的miRNAs定位在腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域(cancerassociatedgenomicregions，CAGR)，包括LOH區(qū)、染色體擴(kuò)增區(qū)及脆性位點(diǎn)等，其表達(dá)水平在許多腫瘤中發(fā)生改變，可能起到原癌基因或腫瘤抑制基因的作用，因此也將此類miRNA稱作oncomirs。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)多個(gè)發(fā)揮原癌基因或腫瘤抑制基因作用的miRNAs，如let-7、miR-21、miR-17-92cluster、miR-143和miR-145

5、、miR-372和miR-373以及miR-26a等，它們通過調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯參與了腫瘤的演進(jìn)過程。 Hsa-miR-26a(miR-26a)首先從Hela細(xì)胞克隆得到，全長(zhǎng)21nt，在多種組織泛表達(dá)，其表達(dá)無組織特異性。研究表明，miR-26a的表達(dá)失調(diào)參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移，如肺癌、甲狀腺癌、子宮平滑肌肉瘤、乳腺癌和結(jié)腸癌等。lorio等報(bào)道m(xù)iR-26a在雌激素受體陽性(ER+)、孕激素受體陽性(PR

6、+)和低增殖指數(shù)的乳腺癌標(biāo)本中的表達(dá)要高于ER-、PR-和高增殖指數(shù)的標(biāo)本，且與乳腺癌病人的預(yù)后密切相關(guān)。Shi和Yanaihara等的研究結(jié)果表明miR-26a在發(fā)生3pLoH的肺癌細(xì)胞系中表達(dá)降低，同時(shí)其前體pre-mir-26a-1在原發(fā)性肺癌中的表達(dá)也低于正常肺組織。Ⅺ等研究表明miR-26a在結(jié)腸癌細(xì)胞系Hct-116(wt-p53)中的表達(dá)水平是Hct-116(null-p53)的2.27倍，并通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到miR-2

7、6a啟動(dòng)子區(qū)具有p53的結(jié)合位點(diǎn)，siRNA(smallinterferingRNA)沉默p53表達(dá)后引起了miR-26a的表達(dá)降低，此外5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)處理后發(fā)現(xiàn)p53表達(dá)增高的同時(shí)引起了miR-26a的表達(dá)上調(diào)，因而他們推測(cè)p53作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于其啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控miR-26a的表達(dá)。Visone等發(fā)現(xiàn)miR-26a在間變性甲狀腺癌(anaplasticthyroidcarcinoma，ATC)組

8、織中的表達(dá)要低于正常甲狀腺組織，將miR-26a前體轉(zhuǎn)染ATC細(xì)胞株使其過表達(dá)后抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖，推測(cè)其可能通過調(diào)控靶基因.HMGA1和HMGA2的表達(dá)參與了甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展。值得注意的是，miR-26a定位在3p23-21.31(MDR2)-D的D3S1768-D3S1767全長(zhǎng)12.32Mb的區(qū)域，此區(qū)域恰好為鼻咽癌雜合子缺失高頻區(qū)。因而，鼻咽癌患者3號(hào)染色體發(fā)生LOH是否引起miR-26a的表達(dá)失調(diào)，miR-26a的表達(dá)失

9、調(diào)在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中又扮演著何種角色以及miR-26a是否可以作為鼻咽癌的一個(gè)oncomir等一系列問題都值得我們深入探討。 基于miR-26a的研究現(xiàn)狀及其在明確鼻咽癌癌變?cè)缙诘姆肿訖C(jī)制中的潛在意義，本課題的研究目的為鑒定miR-26a在鼻咽癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)特性，然后通過改變miR-26a的表達(dá)水平觀察對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，最后結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析其靶基因，闡明miR-26a在鼻咽癌發(fā)病機(jī)制中所扮演的角色，

10、為深入理解鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制和尋找新的分子靶向治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)，為此本課題進(jìn)行了如下研究： (一)鼻咽癌中miR-26a表達(dá)特性的鑒定 采用熒光定量RT-PCR的方法檢測(cè)了5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1和HONE1等6種鼻咽癌細(xì)胞株和永生化鼻咽上皮細(xì)胞株NP69中miR-26a的表達(dá)情況，結(jié)果顯示7種細(xì)胞株中miR-26a的表達(dá)差異具有顯著性(F=111.846，P<0.001)。運(yùn)用2-△

11、△Ct法對(duì)6種鼻咽癌細(xì)胞株中miR-26a的表達(dá)水平與NP69相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-26a在5-8F、CNE1、CNE2、C666-1、HONE1中的表達(dá)水平均低于NP69，而在6-10B中的表達(dá)水平高于NP69。 采用原位雜交的方法檢測(cè)鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎組織中miR-26a的表達(dá)特性，結(jié)果顯示miR-26a在鼻咽癌組織中為陰性表達(dá)，而在慢性鼻咽炎組織中miR-26a的強(qiáng)陽性信號(hào)定位于假復(fù)層纖毛柱狀上皮。 上述實(shí)驗(yàn)

12、結(jié)果提示我們由于3號(hào)染色體短臂發(fā)生LOH導(dǎo)致了miR-26a的表達(dá)失調(diào)，但其表達(dá)失調(diào)對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響以及調(diào)控的具體機(jī)制仍不明確。 (二)miR-26a靶基因的預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析 利用miRBase、Pictar和TargetScan三個(gè)經(jīng)典靶基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)miR-26a進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示miRBase預(yù)測(cè)靶基因有1114個(gè)，TargetScan預(yù)測(cè)有536個(gè)，Pictar預(yù)測(cè)有501個(gè)，三者取交集后

13、共有56個(gè)靶基因。隨后對(duì)該56個(gè)靶基因進(jìn)行初步的基因功能分析(GeneOntologyenrichmentanalysis)，發(fā)現(xiàn)它們的生物學(xué)功能主要包括轉(zhuǎn)移酶活性、金屬離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子、受體活性、細(xì)胞周期調(diào)控、RAS蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、NF-KB信號(hào)通路的正調(diào)控以及細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、粘附和運(yùn)動(dòng)等。由于這些生物學(xué)功能涉及到了腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的多個(gè)階段，因而我們推測(cè)miR-26a在鼻咽癌中的表達(dá)失調(diào)，可能通過調(diào)控下游一系

14、列靶基因的表達(dá)進(jìn)而引起鼻咽癌細(xì)胞多方面生物學(xué)特性的改變。 生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)靶基因的結(jié)果提示我們miR-26a的表達(dá)失調(diào)可能會(huì)影響鼻咽癌細(xì)胞的生物學(xué)特性并提供了初步線索，為深入探討miR-26a的調(diào)控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。 (三)miR-26a過表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 通過克隆重組miR-26a前體及上下游的側(cè)翼序列，構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體plVTHM/miR-26a，病毒包裝后感染5-8F細(xì)胞，然后流式細(xì)胞

15、儀分選鑒定GFP+細(xì)胞，建立了穩(wěn)定過表達(dá)miR-26a的鼻咽癌細(xì)胞株5-8F-plVTHM/miR-26a。 采用MTT法檢測(cè)miR-26a過表達(dá)后細(xì)胞的體外增殖情況，結(jié)果顯示，與5-8F-plVTHM和5-8F細(xì)胞相比，5-8F-plVTHM/miR-26a細(xì)胞的增殖速度顯著減慢，并且呈時(shí)間依賴關(guān)系(F=5.146，P<0.001)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果同樣顯示三組細(xì)胞的增殖能力具有顯著性差異(F=38.862，P<0.00

16、1)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，結(jié)果顯示三組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布并無顯著性差異。綜上所述，miR-26a，的過表達(dá)顯著抑制了鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖能力。 采用Transwell小室檢測(cè)miR-26a過表達(dá)后細(xì)胞體外遷移運(yùn)動(dòng)能力的改變，結(jié)果顯示，與5-8F-plVTHM和5-8F細(xì)胞相比，5-8F-plVTHM/miR-26a細(xì)胞穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)減少，差異具有顯著性(F=53.881，P<0.001)。Boyden小

17、室檢測(cè)miR-26a過表達(dá)后細(xì)胞體外侵襲能力的改變后發(fā)現(xiàn)三組細(xì)胞的侵襲能力具有顯著性差異(F=109.334，P<0.001)，5-8F-plVTHM/miR-26a細(xì)胞的侵襲能力顯著降低。以上結(jié)果表明，miR-26a過表達(dá)后顯著降低了鼻咽癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。 結(jié)論： 1.熒光定量RT-PCR和原位雜交的結(jié)果表明，miR-26a在鼻咽癌細(xì)胞株和組織中表達(dá)失調(diào)。 2.miR-26a過表達(dá)后顯著抑制了鼻咽癌細(xì)