鼻咽癌中hsa-miR-26a功能的初步研究.pdf

1、鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)是我國南方及東南亞地區(qū)常見的一種惡性腫瘤，尤以廣東省珠江三角洲一帶多見，故有“廣東瘤”之稱。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段、多步驟遺傳變異積累的復雜過程，與愛波斯坦.巴爾病毒(EpsteinBarrVirus，EBV)感染、化學促癌物和/或致癌物以及遺傳因素密切相關。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌發(fā)病具有民族、地域和家族聚集現(xiàn)象，遺傳易感因素如3p、9p和14q等染色體的等

2、位基因雜合子缺失(Iossofheterozygosity，LOH)與鼻咽癌發(fā)生密切相關，說明該惡性腫瘤是一種涉及多個基因改變的遺傳性疾病。但迄今為止，鼻咽癌發(fā)病的分子機制尚未完全闡明。 多項研究結果表明，鼻咽癌患者在3號染色體短臂最常發(fā)生連續(xù)性、非隨機性LOH，其中3p14-21(FHIT)、3p21.3-22和3p25-26(VHL)是原發(fā)性鼻咽癌LOH高頻區(qū)，且3號染色體短臂的遺傳學改變常發(fā)生在鼻咽部上皮細胞表型發(fā)生異常和

3、EBV感染之前，是鼻咽癌發(fā)生過程中的極早期事件。因此，在3號染色體短臂尋找鼻咽癌相關的未知基因對于揭示鼻咽癌癌變早期的分子機制具有重要的意義。 MicroRNA(miRNA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類非編碼單鏈小分子RNA，長約19-25個核苷酸(nucleotide，nt)，在轉錄后水平調控基因的表達，與動植物的組織器官發(fā)育、細胞分化和凋亡、胰島素分泌、脂肪代謝等生命活動密切相關，其表達異常將導致重大疾病，例如腫瘤的發(fā)生。研究表明，

4、50％以上的miRNAs定位在腫瘤相關的基因組區(qū)域(cancerassociatedgenomicregions，CAGR)，包括LOH區(qū)、染色體擴增區(qū)及脆性位點等，其表達水平在許多腫瘤中發(fā)生改變，可能起到原癌基因或腫瘤抑制基因的作用，因此也將此類miRNA稱作oncomirs。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)多個發(fā)揮原癌基因或腫瘤抑制基因作用的miRNAs，如let-7、miR-21、miR-17-92cluster、miR-143和miR-145

5、、miR-372和miR-373以及miR-26a等，它們通過調控下游靶基因的轉錄和翻譯參與了腫瘤的演進過程。 Hsa-miR-26a(miR-26a)首先從Hela細胞克隆得到，全長21nt，在多種組織泛表達，其表達無組織特異性。研究表明，miR-26a的表達失調參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移，如肺癌、甲狀腺癌、子宮平滑肌肉瘤、乳腺癌和結腸癌等。lorio等報道m(xù)iR-26a在雌激素受體陽性(ER+)、孕激素受體陽性(PR

6、+)和低增殖指數(shù)的乳腺癌標本中的表達要高于ER-、PR-和高增殖指數(shù)的標本，且與乳腺癌病人的預后密切相關。Shi和Yanaihara等的研究結果表明miR-26a在發(fā)生3pLoH的肺癌細胞系中表達降低，同時其前體pre-mir-26a-1在原發(fā)性肺癌中的表達也低于正常肺組織。Ⅺ等研究表明miR-26a在結腸癌細胞系Hct-116(wt-p53)中的表達水平是Hct-116(null-p53)的2.27倍，并通過生物信息學預測到miR-2

7、6a啟動子區(qū)具有p53的結合位點，siRNA(smallinterferingRNA)沉默p53表達后引起了miR-26a的表達降低，此外5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)處理后發(fā)現(xiàn)p53表達增高的同時引起了miR-26a的表達上調，因而他們推測p53作為轉錄因子結合于其啟動子區(qū)調控miR-26a的表達。Visone等發(fā)現(xiàn)miR-26a在間變性甲狀腺癌(anaplasticthyroidcarcinoma，ATC)組

8、織中的表達要低于正常甲狀腺組織，將miR-26a前體轉染ATC細胞株使其過表達后抑制了腫瘤細胞的增殖，推測其可能通過調控靶基因.HMGA1和HMGA2的表達參與了甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展。值得注意的是，miR-26a定位在3p23-21.31(MDR2)-D的D3S1768-D3S1767全長12.32Mb的區(qū)域，此區(qū)域恰好為鼻咽癌雜合子缺失高頻區(qū)。因而，鼻咽癌患者3號染色體發(fā)生LOH是否引起miR-26a的表達失調，miR-26a的表達失

9、調在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中又扮演著何種角色以及miR-26a是否可以作為鼻咽癌的一個oncomir等一系列問題都值得我們深入探討。 基于miR-26a的研究現(xiàn)狀及其在明確鼻咽癌癌變早期的分子機制中的潛在意義，本課題的研究目的為鑒定miR-26a在鼻咽癌細胞和組織中的表達特性，然后通過改變miR-26a的表達水平觀察對于鼻咽癌細胞生物學特性的影響，最后結合生物信息學預測和分析其靶基因，闡明miR-26a在鼻咽癌發(fā)病機制中所扮演的角色，

10、為深入理解鼻咽癌發(fā)病的分子機制和尋找新的分子靶向治療靶點奠定理論基礎，為此本課題進行了如下研究： (一)鼻咽癌中miR-26a表達特性的鑒定 采用熒光定量RT-PCR的方法檢測了5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、C666-1和HONE1等6種鼻咽癌細胞株和永生化鼻咽上皮細胞株NP69中miR-26a的表達情況，結果顯示7種細胞株中miR-26a的表達差異具有顯著性(F=111.846，P<0.001)。運用2-△

11、△Ct法對6種鼻咽癌細胞株中miR-26a的表達水平與NP69相比較，結果發(fā)現(xiàn)miR-26a在5-8F、CNE1、CNE2、C666-1、HONE1中的表達水平均低于NP69，而在6-10B中的表達水平高于NP69。 采用原位雜交的方法檢測鼻咽癌組織和慢性鼻咽炎組織中miR-26a的表達特性，結果顯示miR-26a在鼻咽癌組織中為陰性表達，而在慢性鼻咽炎組織中miR-26a的強陽性信號定位于假復層纖毛柱狀上皮。 上述實驗

12、結果提示我們由于3號染色體短臂發(fā)生LOH導致了miR-26a的表達失調，但其表達失調對于鼻咽癌細胞生物學特性的影響以及調控的具體機制仍不明確。 (二)miR-26a靶基因的預測及生物信息學分析 利用miRBase、Pictar和TargetScan三個經(jīng)典靶基因預測軟件對miR-26a進行靶基因預測，結果顯示miRBase預測靶基因有1114個，TargetScan預測有536個，Pictar預測有501個，三者取交集后

13、共有56個靶基因。隨后對該56個靶基因進行初步的基因功能分析(GeneOntologyenrichmentanalysis)，發(fā)現(xiàn)它們的生物學功能主要包括轉移酶活性、金屬離子結合、轉錄因子、受體活性、細胞周期調控、RAS蛋白信號轉導、轉錄調控、NF-KB信號通路的正調控以及細胞的增殖、凋亡、分化、粘附和運動等。由于這些生物學功能涉及到了腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移的多個階段，因而我們推測miR-26a在鼻咽癌中的表達失調，可能通過調控下游一系

14、列靶基因的表達進而引起鼻咽癌細胞多方面生物學特性的改變。 生物信息學分析預測靶基因的結果提示我們miR-26a的表達失調可能會影響鼻咽癌細胞的生物學特性并提供了初步線索，為深入探討miR-26a的調控機制奠定了理論基礎。 (三)miR-26a過表達對鼻咽癌細胞生物學特性的影響 通過克隆重組miR-26a前體及上下游的側翼序列，構建慢病毒表達載體plVTHM/miR-26a，病毒包裝后感染5-8F細胞，然后流式細胞

15、儀分選鑒定GFP+細胞，建立了穩(wěn)定過表達miR-26a的鼻咽癌細胞株5-8F-plVTHM/miR-26a。 采用MTT法檢測miR-26a過表達后細胞的體外增殖情況，結果顯示，與5-8F-plVTHM和5-8F細胞相比，5-8F-plVTHM/miR-26a細胞的增殖速度顯著減慢，并且呈時間依賴關系(F=5.146，P<0.001)。平板克隆形成實驗的結果同樣顯示三組細胞的增殖能力具有顯著性差異(F=38.862，P<0.00

16、1)。流式細胞儀檢測三組細胞的細胞周期分布，結果顯示三組細胞的細胞周期分布并無顯著性差異。綜上所述，miR-26a，的過表達顯著抑制了鼻咽癌細胞的體外增殖能力。 采用Transwell小室檢測miR-26a過表達后細胞體外遷移運動能力的改變，結果顯示，與5-8F-plVTHM和5-8F細胞相比，5-8F-plVTHM/miR-26a細胞穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)減少，差異具有顯著性(F=53.881，P<0.001)。Boyden小

17、室檢測miR-26a過表達后細胞體外侵襲能力的改變后發(fā)現(xiàn)三組細胞的侵襲能力具有顯著性差異(F=109.334，P<0.001)，5-8F-plVTHM/miR-26a細胞的侵襲能力顯著降低。以上結果表明，miR-26a過表達后顯著降低了鼻咽癌細胞的體外遷移和侵襲能力。 結論： 1.熒光定量RT-PCR和原位雜交的結果表明，miR-26a在鼻咽癌細胞株和組織中表達失調。 2.miR-26a過表達后顯著抑制了鼻咽癌細