NESG1基因的序列修正及其在鼻咽癌中的功能及分子機(jī)制初步研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma)是我國南方省份及東南亞高發(fā)的一種惡性腫瘤,具有明顯的種族聚集性和地域性。其發(fā)生是一個多階段、多途徑、多機(jī)制的過程。流行病學(xué)調(diào)查顯示,鼻咽癌的發(fā)生涉及到遺傳傾向性和環(huán)境致癌因素,很可能是遺傳易感性個體接受了致癌物的作用而發(fā)生的。EB病毒(EBV)、化學(xué)致癌物和胚性擊中(即遺傳因素或自發(fā)突變)構(gòu)成NPC的主要病因,而發(fā)病階段至少在兩個以上。各種環(huán)境因素

2、、EBV感染、遺傳和表遺傳學(xué)的改變導(dǎo)致瘤基因過表達(dá)及抑瘤基因表達(dá)下調(diào)或缺失,經(jīng)過癌前病變,最終發(fā)生鼻咽癌。
　　 腫瘤的生成涉及多種基因和基因以外的變化,任何單獨一種基因的改變不足以致瘤,多種基因變化的積累才能引起控制細(xì)胞生長和分化的機(jī)制紊亂,使細(xì)胞的生長失控而瘤變。在這些基因的變化中,最常發(fā)生兩類基因的異常變化,即瘤基因及腫瘤抑制基因。鼻咽癌的生成同樣涉及多基因的表達(dá)改變。在過去幾十年中,雖然我們對于鼻咽癌發(fā)生的分子基礎(chǔ)認(rèn)識已

3、經(jīng)有了很大的提高,但這些認(rèn)識還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能完全揭示鼻咽癌的發(fā)病機(jī)理。因此,鼻咽癌相關(guān)新基因的發(fā)現(xiàn)和研究仍將有助于進(jìn)一步揭示鼻咽癌的發(fā)病機(jī)理。
　　 NESG1基因(Genbank AF094758),官方名為CCDC19(NM_012337.1),是本課題組姚開泰教授指導(dǎo)的博士生黎眾魁于1999年利用mRNA差異顯示法,從人正常鼻咽上皮和軟腭口腔上皮中篩選,并結(jié)合3'-RACE和5'-RACE技術(shù),分別擴(kuò)增出長約1.4kb和0.7

4、kb的片段(其中包含了一段174bp的重疊產(chǎn)物以確認(rèn)擴(kuò)增的特異性),拼接后發(fā)現(xiàn)的一個全長約1850bp連續(xù)的cDNA序列。該基因位于1q22。預(yù)測其編碼框長1161bp,編碼386個氨基酸,分子量為46252Da,蛋白質(zhì)等電點為9.99,SOSUI和PSORTⅡ網(wǎng)上預(yù)測其為可溶性核蛋白。BLAST比對發(fā)現(xiàn),NESG1的cDNA序列與胎兒肺組織cDNA文庫和Stratagene肺癌cDNA文庫中的兩個EST序列同源。多組織(包括鼻咽粘膜、

5、氣管、食管、大腦、心臟、膀胱、肝臟、肺臟、胃、腎臟、胸腺和大腸)Northern雜交顯示,該基因特異性的表達(dá)于鼻咽和氣管纖毛柱狀上皮。
　　 本課題在此研究基礎(chǔ)上,對NESG1基因進(jìn)行重新克隆測序分析及功能鑒定,并尋找NESG1基因相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,探討該基因在鼻咽癌中的作用機(jī)制,為進(jìn)一步闡明鼻咽癌發(fā)病機(jī)理提供參考。
　　 研究內(nèi)容與方法
　　 1.NESG1基因的序列修正以及新序列的生物信息學(xué)分析
　　

6、 對NESG1基因進(jìn)行了重新克隆、測序分析并對其序列進(jìn)行修正,重新預(yù)測編碼框。對新校正序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　 2.NESG1基因在鼻咽癌中表達(dá)水平檢測
　　 (1).NESG1基因mRNA表達(dá)水平
　　 利用RT-PCR和Real-time PCR檢測NESG1 mRNA在鼻咽癌細(xì)胞、鼻咽癌組織與非癌鼻咽組織中的表達(dá)情況；原位雜交檢測NESG1基因的mRNA表達(dá)定位。
　　 (2).NESG1兔

7、抗人多克隆抗體制備及NESG1蛋白表達(dá)
　　 構(gòu)建pGEX-4T-1-NESG1-GST原核融合表達(dá)載體。IPTG誘導(dǎo)NESG1-GST基因融合表達(dá)。利用GST抗體純化融合蛋白用于免疫大白兔,約100天后取兔血上清,并親和純化,最后獲得所需的NESG1多克隆抗體。利用免疫組化和Western blot檢測NESG1蛋白在鼻咽癌組織與非癌鼻咽組織中的表達(dá)情況。利用免疫組化檢測鼻咽外多組織中NESG1的表達(dá)分布。
　　 3.

8、NESG1基因在鼻咽癌中的功能初步研究
　　 (1).NESG1過表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞5-8F生物學(xué)特性的影響
　　 構(gòu)建與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白融合表達(dá)的NESG1慢病毒載體,利用293FT細(xì)胞包裝成成熟的慢病毒顆粒,感染具有高成瘤和高轉(zhuǎn)移能力的鼻咽癌細(xì)胞5-8F。96孔板有限稀釋法挑選陽性單克隆細(xì)胞,擴(kuò)大培養(yǎng),建立穩(wěn)定過表達(dá)NESG1的鼻咽癌細(xì)胞株,以空載體同時進(jìn)行病毒包裝及感染鼻咽癌細(xì)胞5-8F,獲得對照細(xì)胞株。利用MTT

9、法、平板克隆形成實驗、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室遷移實驗及Boyden小室侵襲實驗等檢測NESG1基因在細(xì)胞水平對細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、遷移及侵襲能力的影響；檢測穩(wěn)定過表達(dá)NESG1的鼻咽癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力的改變。
　　 (2).抑制NESG1表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞5-8F生物學(xué)特性的影響
　　 構(gòu)建靶向NESG1的shRNA慢病毒干擾載體,穩(wěn)定干擾過表達(dá)NESG1基因的鼻咽癌細(xì)胞,利用MTT法、平板克隆形成實驗、T

10、ranswell小室遷移實驗及Boyden小室侵襲實驗等觀察NESG1表達(dá)抑制后細(xì)胞生長、遷移及侵襲能力的變化。進(jìn)一步探討NESG1基因在鼻咽癌細(xì)胞中的基本功能。
　　 4.NESG1基因介導(dǎo)的分子基礎(chǔ)初步研究
　　 (1).應(yīng)用Affymetrix全基因組芯片檢測NESG1基因穩(wěn)定導(dǎo)入前后對鼻咽癌細(xì)胞基因表達(dá)的影響,尋找差異表達(dá)基因
　　 (2).利用生物信息學(xué)的方法,分析基因芯片差異表達(dá)基因介導(dǎo)的信號通路

11、r>　　 (3).NESG1抑制細(xì)胞周期進(jìn)展的初步分子機(jī)制
　　 由于過表達(dá)的NESG1能阻滯細(xì)胞周期由G1向S期轉(zhuǎn)化,因此,NESG1參與抑制了細(xì)胞周期的進(jìn)展。基于基因芯片的數(shù)據(jù),我們利用熒光定量RT-PCR和Western blot驗證了S期相關(guān)的幾個重要基因CCND1、CCNA1、CDK4、p21、CDK2、CDC2的表達(dá),初步探討了NESG1基因抑制細(xì)胞周期進(jìn)展的機(jī)制。
　　 結(jié)果
　　 1.NESG1

12、基因的序列修正以及新序列的生物信息學(xué)分析
　　 (1).NESG1基因的序列修正
　　 (2).序列修正后NESG1基因的生物信息學(xué)分析
　　 2.NESG1基因在鼻咽癌中表達(dá)水平檢測
　　 (1).NESG1基因mRNA表達(dá)水平
　　 原位雜交顯示,NESG1基因表達(dá)在鼻咽粘膜纖毛柱狀上皮細(xì)胞的細(xì)胞核、漿內(nèi)。半定量RT-PCR和熒光定量RT-PCR均顯示,與非癌鼻咽組織相比,NESG1基因在鼻咽

13、癌組織和細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)(t=19.819,P<0.001)。
　　 (2).NESG1兔抗人多克隆抗體制備及NESG1蛋白表達(dá)
　　 3.NESG1基因在鼻咽癌中的功能初步研究
　　 (1).NESG1過表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞5-8F生物學(xué)特性的影響
　　 (2).抑制NESG1表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞5-8F生物學(xué)特性的影響
　　 4.NESG1基因介導(dǎo)的分子基礎(chǔ)初步研究
　　 (1).Affym

14、etrix全基因組表達(dá)譜芯片
　　 對NESG1-2F4和C6空載對照細(xì)胞進(jìn)行Affymetrix全基因組表達(dá)譜芯片檢測,一共檢測到了2400多個差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因797個,下調(diào)基因1707個。將這些差異表達(dá)基因進(jìn)行了初步的Pathway分析,結(jié)果顯示NESG1基因參與多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,其中包括Tight junction、MAPK通路和Cell cycle通路等。
　　 (2).NESG1抑制細(xì)胞周期進(jìn)展初步機(jī)

15、制研究
　　 結(jié)論
　　 1.修正了NESG1基因的序列,使其在Genbank數(shù)據(jù)庫中的版本由最初的NM_012337.1升級為NM_012337.2。
　　 2.NESG1穩(wěn)定導(dǎo)入鼻咽癌細(xì)胞5-8F后,細(xì)胞的體內(nèi)、外增殖、遷移和侵襲能力顯著下降,在NESG1表達(dá)更強(qiáng)的2F4細(xì)胞中,細(xì)胞出現(xiàn)了G1向S期轉(zhuǎn)化障礙,細(xì)胞阻滯在G1期。在抑制NESG1表達(dá)后,細(xì)胞增殖能力、遷移和侵襲能力顯著恢復(fù)。這提示,NESG1在鼻

16、咽癌中是一個腫瘤抑制相關(guān)基因。
　　 NESG1通過抑制CCNA1和上調(diào)p21的表達(dá),參與了鼻咽癌細(xì)胞周期進(jìn)展的調(diào)控。
　　 本研究創(chuàng)新之處
　　 1.修正了NESG1基因的序列,更新了NESG1在Genbank數(shù)據(jù)庫中的版本號。
　　 2.對NESG1基因進(jìn)行了表達(dá)定位,在mRNA和蛋白水平證實了NESG1基因在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào),為理解和研究鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制提供了線索。
　　 3.初步證實N

17、ESG1基因與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,并且將細(xì)胞阻滯在G1期。
　　 4.基因芯片分析顯示,NESG1參與介導(dǎo)了Tight junction、MAPK和Cell cycle等多條信號通路,這為研究NESG1在鼻咽癌中介導(dǎo)的信號通路提供了關(guān)鍵的線索。
　　 5.NESG1抑制CCNA1的表達(dá)和上調(diào)p21的表達(dá),阻礙了鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)展。
　　 6.NESG1基因是本