外泌體介導(dǎo)分泌型miR-9抑制鼻咽癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　鼻咽癌是我國南方及東南亞地區(qū)一種常見的惡性腫瘤，臨床以分化低、高轉(zhuǎn)移為主要特征，臨床上75％～90％的鼻咽癌病人初診時已是局部晚期并發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。盡管以調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)為主的放化療綜合治療使鼻咽癌的局控率有明顯提高，但目前臨床上仍無法對鼻咽癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行早期預(yù)測和有效干預(yù)，其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率和總體生存率并沒有顯著改觀，一旦復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移則預(yù)后較差，平均中位生存期只有7.3～10個月，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍是病人死亡的主要原因。因此，全面解析鼻

2、咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，積極尋求切實(shí)有效且安全可靠的治療新途徑，是有效控制鼻咽癌轉(zhuǎn)移從而提高患者生存率的關(guān)鍵。
　　外泌體被證實(shí)能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與周圍組分進(jìn)行信號傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)、核酸等內(nèi)容物垂直傳遞來誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成，促進(jìn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。因此，外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到了非常重要的作用，可以是預(yù)測和預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物和新治療靶點(diǎn)。腫瘤血管生成和血管通透性增加亦是轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的特點(diǎn)之一，是促進(jìn)轉(zhuǎn)移的必要條件，亦被認(rèn)為是治療腫瘤和防止腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)

3、移的靶點(diǎn)。目前，已有腫瘤血管靶向藥物用于臨床并取得了鼓舞人心的臨床療效。但腫瘤的血管生成是個極其復(fù)雜的過程，且大多數(shù)腫瘤血管靶向治療藥物均針對非特異性地阻斷VEGF信號通路，導(dǎo)致產(chǎn)生血壓升高等副作用和藥物抵抗性。因此，還需要積極地去尋找全新的特異性更高的腫瘤血管治療靶點(diǎn)，增強(qiáng)腫瘤血管靶向治療的效果。
　　研究顯示microRNA在腫瘤血管生成機(jī)制中扮演著重要的角色，影響血管生成的miRNA被命名為angiomiR。angiomiR

4、的發(fā)現(xiàn)為腫瘤血管靶向治療開辟了新的領(lǐng)域，與既往單一靶點(diǎn)的抗血管生成藥物相比，如若能通過糾正angiomiR的表達(dá)異常達(dá)到抑制腫瘤血管生成的目的，則有可能避免藥物的副作用及藥物的抵抗性。腫瘤細(xì)胞被證實(shí)分泌microRNA由外泌體介導(dǎo)進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞影響腫瘤的血管生成。
　　在本課題組前期的研究中，miR-9被證實(shí)參與鼻咽癌轉(zhuǎn)移，但其表達(dá)異常是否能影響腫瘤血管生成繼而影響轉(zhuǎn)移，以及鼻咽癌細(xì)胞是否能分泌miR-9由外泌體運(yùn)載進(jìn)入血管內(nèi)皮

5、細(xì)胞從而影響血管生成等一系列問題都不得而知。因此，為了明確miR-9表達(dá)失調(diào)對鼻咽癌血管生成的影響，證實(shí)鼻咽癌細(xì)胞分泌的miR-9以外泌體介導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮功能，闡明分泌型miR-9對血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生影響的分子機(jī)制和信號通路，我們進(jìn)行了相應(yīng)的研究。
　　材料和方法:
　　1、免疫組化和原位雜交:50例鼻咽癌組織石蠟標(biāo)本切片行CD31免疫組化與miR-9原位雜交;100例鼻咽癌組織和80例鼻咽炎組織石蠟標(biāo)本切片行MDK免疫組

6、化。
　　2、慢病毒包裝感染、exosome抽提及鑒定、示蹤實(shí)驗(yàn):慢病毒包裝感染構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-9、空載對照5-8F和CNE1細(xì)胞株;細(xì)胞上清液收集，差速離心法提取外泌體/Exoquick試劑提取外泌體;nanosight、westem blot(CD63、TSG101)、電鏡驗(yàn)證外泌體;RNA提取，RT-qPCR檢測miR-9基因表達(dá);CY3標(biāo)記miR-9，PKH67標(biāo)記外泌體，激光共聚焦顯微鏡示蹤實(shí)驗(yàn)。
　　3、體

7、內(nèi)外功能試驗(yàn):CCK8、侵襲實(shí)驗(yàn)、成管實(shí)驗(yàn)、基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)。
　　4、靶基因預(yù)測及驗(yàn)證:Targetscan、Pictar、miRBase生物信息學(xué)軟件預(yù)測靶基因，RT-qPCR對候選靶基因進(jìn)行篩選;針對篩選出來的靶基因MDK使用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)及western blot進(jìn)行驗(yàn)證;磷酸化抗體芯片及western blot檢測信號通路PI3K/AKT和MAPK磷酸化蛋白水平
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.

8、0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料兩組間差異比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independent-samples t test)。采用Spearman法對免疫組化和原位雜交半定量結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。CCK8增殖實(shí)驗(yàn)采用析因方差分析(factorial design ANOVA)。多組等級資料的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，分類數(shù)據(jù)利用x2檢驗(yàn)進(jìn)行比較。Kaplan-Meier法繪制生存曲線。生存期的多因素分析采用Cox回歸模型。

9、r>　　結(jié)果：
　　1、鼻咽癌組織標(biāo)本中，Ⅲ～Ⅳ期miR-9表達(dá)顯著降低（Z=-3.635，P＜0.001），MVD顯著升高(t=-3.507，P=0.001)，miR-9表達(dá)與MVD表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3075，P=0.0298)。
　　2、穩(wěn)定過表達(dá)miR-9鼻咽癌細(xì)胞株的建立及exosome的抽提和鑒定:穩(wěn)定過表達(dá)miR-9的鼻咽癌細(xì)胞株5-8F Lv-miR-9中，miR-9表達(dá)量為對照組細(xì)胞的61.487倍(P

10、=0.0016);CNE1Lv-miR-9細(xì)胞株中miR-9的表達(dá)為對照組細(xì)胞的48.05倍(P=0.0048)。穩(wěn)定過表達(dá)miR-9的鼻咽癌細(xì)胞株均可以分泌外泌體，與對照組相比，其外泌體的數(shù)量和形態(tài)相似，外泌體中miR-9的表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)miR-9表達(dá)水平一致，過表達(dá)miR-9組5-8F Lv-miR-9外泌體中miR-9表達(dá)為對照組外泌體的36.56倍(P=0.0016);CNE1Lv-miR-9外泌體中miR-9表達(dá)為對照組外泌體的

11、24.77倍(P=0.0015)。激光共聚焦結(jié)果顯示鼻咽癌細(xì)胞分泌紅色熒光CY3標(biāo)記的miR-9由綠色熒光標(biāo)記的PKH67-外泌體運(yùn)載進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞
　　3、體內(nèi)外功能實(shí)驗(yàn):CCK8結(jié)果顯示5-8F Lv-miR-9外泌體誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)增殖能力顯著降低(P＜0.001)，CNE1Lv-miR-9外泌體誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞增殖能力顯著降低(P＜0.001);侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5-8F Lv-miR-9外泌體誘導(dǎo)的HUVECs

12、穿膜細(xì)胞數(shù)減少78.11％(P＜0.001)，CNE1Lv-miR-9外泌體誘導(dǎo)的HUVECs穿膜細(xì)胞數(shù)減少63.51％(P＜0.001);成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5-8FLv-miR-9外泌體誘導(dǎo)的HUVECs相對小管長度縮短65.00％(P＜0.001)，CNE1Lv-miR-9外泌體誘導(dǎo)的HUVECs相對小管長度縮短56.86％(P＜0.001);基質(zhì)膠栓實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)miR-9組膠栓內(nèi)新生血管顯著少于對照組膠栓，過表達(dá)miR-9組外

13、泌體誘導(dǎo)的HUVECs相對小管長度縮短68.18％（P＜0.001）。
　　4、靶基因預(yù)測及驗(yàn)證:靶基因篩選結(jié)果顯示在由生物信息學(xué)軟件預(yù)測的17個靶基因中，分泌型miR-9導(dǎo)致其中9個表達(dá)有差異，差異最顯著的為MDK（t=37.500，P=0.001）;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)顯示分泌型miR-9能與MDK3'UTR特異性結(jié)合影響熒光活性（t=33.924，P=0.000），但不能與MDK mt3'UTR結(jié)合（t=0.975，P=0

14、.385）。瞬轉(zhuǎn)miR-9inhibitor，可以抑制分泌型miR-9與MDK3'UTR結(jié)合，使熒光活性增強(qiáng)（t=26.077，P=0.001），對MDK mt3'UTR組熒光活性無影響（t=1.823，P=0.142）;Western blot結(jié)果顯示與對照組相比，過表達(dá)miR-9的外泌體誘導(dǎo)的HUVECs中MDK蛋白表達(dá)水平顯著降低;抗體芯片結(jié)果顯示與與對照組相比，過表達(dá)miR-9的外泌體誘導(dǎo)的HUVECs在PI3K/AKT信號通路

15、上出現(xiàn)七個蛋白磷酸化水平下降，其中差異最顯著的磷酸化蛋白P70S6k和PDK1在western blot上也得到了驗(yàn)證，而MAPK信號通路則未發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸化改變
　　5、免疫組化結(jié)果顯示，慢性鼻咽炎鼻咽部上皮組織中MDK無表達(dá)，鼻咽癌組織中MDK胞漿表達(dá);不同臨床分期的標(biāo)本中MDK表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，在100例鼻咽癌標(biāo)本中，相比于MDK低表達(dá)組而言，MDK高表達(dá)組中患者的T分期(P=0.001)，N分期(P=

16、0.005)和臨床分期(P=0.001)均明顯偏高;Kaplan-Meier生存分析顯示鼻咽癌患者中MDK高表達(dá)患者(OS:53.33個月，95％置信區(qū)間:45.56-61.11;PFS:50.02個月，95％可信區(qū)間:41.51-58.52個月）的預(yù)后要顯著差于MDK低表達(dá)患者（OS:78.13個月，95％置信區(qū)間:72.95-83.31個月;PFS:69.25個月，95％置信區(qū)間:62.81-75.69個月）。組間差異采用Log-r

17、ank檢驗(yàn)分析，結(jié)果分別為OS:Log-rank=14.923，P=0.0001;PFS:Log-rank=10.205，P=0.0014?？傮w生存時間的多因素Cox比例風(fēng)險模型的預(yù)后分析則顯示:MDK表達(dá)水平可作為鼻咽癌總體生存期的獨(dú)立不良預(yù)后因素（RR=0.351，P=0.030）
　　結(jié)論：
　　1、鼻咽癌組織標(biāo)本中miR-9表達(dá)強(qiáng)度與微血管密度呈負(fù)相關(guān)。
　　2、鼻咽癌細(xì)胞分泌miR-9由外泌體介導(dǎo)進(jìn)入血管內(nèi)皮