外泌體介導分泌型miR-9抑制鼻咽癌轉移的機制研究.pdf

1、目的:
　　鼻咽癌是我國南方及東南亞地區(qū)一種常見的惡性腫瘤，臨床以分化低、高轉移為主要特征，臨床上75％～90％的鼻咽癌病人初診時已是局部晚期并發(fā)生頸部淋巴結轉移。盡管以調強放療技術為主的放化療綜合治療使鼻咽癌的局控率有明顯提高，但目前臨床上仍無法對鼻咽癌轉移進行早期預測和有效干預，其遠處轉移率和總體生存率并沒有顯著改觀，一旦復發(fā)或轉移則預后較差，平均中位生存期只有7.3～10個月，遠處轉移仍是病人死亡的主要原因。因此，全面解析鼻

2、咽癌轉移的分子機制，積極尋求切實有效且安全可靠的治療新途徑，是有效控制鼻咽癌轉移從而提高患者生存率的關鍵。
　　外泌體被證實能介導腫瘤細胞與周圍組分進行信號傳導和蛋白質、核酸等內容物垂直傳遞來誘導轉移前微環(huán)境形成，促進轉移的發(fā)生。因此，外泌體在腫瘤轉移中起到了非常重要的作用，可以是預測和預防腫瘤轉移的標記物和新治療靶點。腫瘤血管生成和血管通透性增加亦是轉移前微環(huán)境的特點之一，是促進轉移的必要條件，亦被認為是治療腫瘤和防止腫瘤復發(fā)轉

3、移的靶點。目前，已有腫瘤血管靶向藥物用于臨床并取得了鼓舞人心的臨床療效。但腫瘤的血管生成是個極其復雜的過程，且大多數(shù)腫瘤血管靶向治療藥物均針對非特異性地阻斷VEGF信號通路，導致產生血壓升高等副作用和藥物抵抗性。因此，還需要積極地去尋找全新的特異性更高的腫瘤血管治療靶點，增強腫瘤血管靶向治療的效果。
　　研究顯示microRNA在腫瘤血管生成機制中扮演著重要的角色，影響血管生成的miRNA被命名為angiomiR。angiomiR

4、的發(fā)現(xiàn)為腫瘤血管靶向治療開辟了新的領域，與既往單一靶點的抗血管生成藥物相比，如若能通過糾正angiomiR的表達異常達到抑制腫瘤血管生成的目的，則有可能避免藥物的副作用及藥物的抵抗性。腫瘤細胞被證實分泌microRNA由外泌體介導進入血管內皮細胞影響腫瘤的血管生成。
　　在本課題組前期的研究中，miR-9被證實參與鼻咽癌轉移，但其表達異常是否能影響腫瘤血管生成繼而影響轉移，以及鼻咽癌細胞是否能分泌miR-9由外泌體運載進入血管內皮

5、細胞從而影響血管生成等一系列問題都不得而知。因此，為了明確miR-9表達失調對鼻咽癌血管生成的影響，證實鼻咽癌細胞分泌的miR-9以外泌體介導進入內皮細胞發(fā)揮功能，闡明分泌型miR-9對血管內皮細胞產生影響的分子機制和信號通路，我們進行了相應的研究。
　　材料和方法:
　　1、免疫組化和原位雜交:50例鼻咽癌組織石蠟標本切片行CD31免疫組化與miR-9原位雜交;100例鼻咽癌組織和80例鼻咽炎組織石蠟標本切片行MDK免疫組

6、化。
　　2、慢病毒包裝感染、exosome抽提及鑒定、示蹤實驗:慢病毒包裝感染構建穩(wěn)定過表達miR-9、空載對照5-8F和CNE1細胞株;細胞上清液收集，差速離心法提取外泌體/Exoquick試劑提取外泌體;nanosight、westem blot(CD63、TSG101)、電鏡驗證外泌體;RNA提取，RT-qPCR檢測miR-9基因表達;CY3標記miR-9，PKH67標記外泌體，激光共聚焦顯微鏡示蹤實驗。
　　3、體

7、內外功能試驗:CCK8、侵襲實驗、成管實驗、基質膠栓實驗。
　　4、靶基因預測及驗證:Targetscan、Pictar、miRBase生物信息學軟件預測靶基因，RT-qPCR對候選靶基因進行篩選;針對篩選出來的靶基因MDK使用雙熒光素酶報告基因實驗及western blot進行驗證;磷酸化抗體芯片及western blot檢測信號通路PI3K/AKT和MAPK磷酸化蛋白水平
　　5、統(tǒng)計學分析:應用統(tǒng)計學軟件SPSS20.

8、0進行統(tǒng)計學分析。計量資料兩組間差異比較采用兩獨立樣本t檢驗(independent-samples t test)。采用Spearman法對免疫組化和原位雜交半定量結果進行相關性分析。CCK8增殖實驗采用析因方差分析(factorial design ANOVA)。多組等級資料的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，分類數(shù)據(jù)利用x2檢驗進行比較。Kaplan-Meier法繪制生存曲線。生存期的多因素分析采用Cox回歸模型。

9、r>　　結果：
　　1、鼻咽癌組織標本中，Ⅲ～Ⅳ期miR-9表達顯著降低（Z=-3.635，P＜0.001），MVD顯著升高(t=-3.507，P=0.001)，miR-9表達與MVD表達呈負相關(r=-0.3075，P=0.0298)。
　　2、穩(wěn)定過表達miR-9鼻咽癌細胞株的建立及exosome的抽提和鑒定:穩(wěn)定過表達miR-9的鼻咽癌細胞株5-8F Lv-miR-9中，miR-9表達量為對照組細胞的61.487倍(P

10、=0.0016);CNE1Lv-miR-9細胞株中miR-9的表達為對照組細胞的48.05倍(P=0.0048)。穩(wěn)定過表達miR-9的鼻咽癌細胞株均可以分泌外泌體，與對照組相比，其外泌體的數(shù)量和形態(tài)相似，外泌體中miR-9的表達與細胞內miR-9表達水平一致，過表達miR-9組5-8F Lv-miR-9外泌體中miR-9表達為對照組外泌體的36.56倍(P=0.0016);CNE1Lv-miR-9外泌體中miR-9表達為對照組外泌體的

11、24.77倍(P=0.0015)。激光共聚焦結果顯示鼻咽癌細胞分泌紅色熒光CY3標記的miR-9由綠色熒光標記的PKH67-外泌體運載進入血管內皮細胞
　　3、體內外功能實驗:CCK8結果顯示5-8F Lv-miR-9外泌體誘導的HUVECs細增殖能力顯著降低(P＜0.001)，CNE1Lv-miR-9外泌體誘導的HUVECs細胞增殖能力顯著降低(P＜0.001);侵襲實驗結果顯示5-8F Lv-miR-9外泌體誘導的HUVECs

12、穿膜細胞數(shù)減少78.11％(P＜0.001)，CNE1Lv-miR-9外泌體誘導的HUVECs穿膜細胞數(shù)減少63.51％(P＜0.001);成管實驗結果顯示5-8FLv-miR-9外泌體誘導的HUVECs相對小管長度縮短65.00％(P＜0.001)，CNE1Lv-miR-9外泌體誘導的HUVECs相對小管長度縮短56.86％(P＜0.001);基質膠栓實驗結果顯示過表達miR-9組膠栓內新生血管顯著少于對照組膠栓，過表達miR-9組外

13、泌體誘導的HUVECs相對小管長度縮短68.18％（P＜0.001）。
　　4、靶基因預測及驗證:靶基因篩選結果顯示在由生物信息學軟件預測的17個靶基因中，分泌型miR-9導致其中9個表達有差異，差異最顯著的為MDK（t=37.500，P=0.001）;雙熒光素酶報告基因實驗顯示分泌型miR-9能與MDK3'UTR特異性結合影響熒光活性（t=33.924，P=0.000），但不能與MDK mt3'UTR結合（t=0.975，P=0

14、.385）。瞬轉miR-9inhibitor，可以抑制分泌型miR-9與MDK3'UTR結合，使熒光活性增強（t=26.077，P=0.001），對MDK mt3'UTR組熒光活性無影響（t=1.823，P=0.142）;Western blot結果顯示與對照組相比，過表達miR-9的外泌體誘導的HUVECs中MDK蛋白表達水平顯著降低;抗體芯片結果顯示與與對照組相比，過表達miR-9的外泌體誘導的HUVECs在PI3K/AKT信號通路

15、上出現(xiàn)七個蛋白磷酸化水平下降，其中差異最顯著的磷酸化蛋白P70S6k和PDK1在western blot上也得到了驗證，而MAPK信號通路則未發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸化改變
　　5、免疫組化結果顯示，慢性鼻咽炎鼻咽部上皮組織中MDK無表達，鼻咽癌組織中MDK胞漿表達;不同臨床分期的標本中MDK表達差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，在100例鼻咽癌標本中，相比于MDK低表達組而言，MDK高表達組中患者的T分期(P=0.001)，N分期(P=

16、0.005)和臨床分期(P=0.001)均明顯偏高;Kaplan-Meier生存分析顯示鼻咽癌患者中MDK高表達患者(OS:53.33個月，95％置信區(qū)間:45.56-61.11;PFS:50.02個月，95％可信區(qū)間:41.51-58.52個月）的預后要顯著差于MDK低表達患者（OS:78.13個月，95％置信區(qū)間:72.95-83.31個月;PFS:69.25個月，95％置信區(qū)間:62.81-75.69個月）。組間差異采用Log-r

17、ank檢驗分析，結果分別為OS:Log-rank=14.923，P=0.0001;PFS:Log-rank=10.205，P=0.0014?？傮w生存時間的多因素Cox比例風險模型的預后分析則顯示:MDK表達水平可作為鼻咽癌總體生存期的獨立不良預后因素（RR=0.351，P=0.030）
　　結論：
　　1、鼻咽癌組織標本中miR-9表達強度與微血管密度呈負相關。
　　2、鼻咽癌細胞分泌miR-9由外泌體介導進入血管內皮