外泌體穿梭miR-21與食管癌發(fā)病關(guān)系研究.pdf

1、外泌體是由細胞分泌的一種納米級的囊泡狀小體，包裹著蛋白質(zhì)、mRNA、microRNAs等生物活性物質(zhì)，參與許多重要的生理、病理過程。本課題主要探討外泌體穿梭miR-21對食管癌細胞生物學功能的影響及其與食管癌發(fā)病風險的關(guān)系。研究利用可視化研究手段捕獲外泌體及其包裹的miR-21從供體細胞穿梭至受體細胞的過程，并通過系列生物學功能實驗和分子生物學實驗，探討外泌體穿梭miR-21對食管癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲能力的影響，及其可能的作用機

2、制。最后結(jié)合食管癌病例對照研究，分析外泌體穿梭miR-21與食管癌發(fā)病風險的關(guān)系。
　　一、食管癌細胞外泌體中miR-21在細胞間的傳遞
　　超速離心法提取EC9706細胞培養(yǎng)液上清中外泌體，用親脂性膜染料DiI染料熒光標記后，應(yīng)用UltraVIEW Vox活細胞激光共聚焦顯微術(shù)追蹤觀察外泌體的運動。活細胞實時成像技術(shù)顯示胞外的外泌體可以通過細胞膜進入到活細胞內(nèi)。
　　研究進一步應(yīng)用Cy3標記miR-21 mimics

3、，瞬時轉(zhuǎn)染供體細胞EC9706，收集培養(yǎng)上清以獲得Cy3標記的外泌體穿梭miR-21，將其加入已處于對數(shù)生長期的受體細胞EC9706中分別繼續(xù)培養(yǎng)3h、6h、24h，流式細胞儀獲得受體熒光細胞的百分比即為外泌體穿梭miR-21的轉(zhuǎn)移效率，采用qRT-PCR技術(shù)檢測受體細胞及其培養(yǎng)上清中miR-21的表達水平。結(jié)果顯示，含有外泌體的培養(yǎng)上清中Cy3-miR-21 mimics在3h、6h、24h時轉(zhuǎn)移到受體細胞的效率分別為60.3％、82

4、.6％和85.0％，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示在各時間點轉(zhuǎn)染組miR-21的表達水平均高于對照組，在受體細胞中平均倍數(shù)變化分別為1.49，1.41，2.08，而在受體細胞上清中分別是147.03，19.29，15.35，表明培養(yǎng)6h后大部分外泌體來源的miR-21 mimics被轉(zhuǎn)移進入受體細胞。
　　應(yīng)用不同濃度的GW4869處理對數(shù)生長期的細胞48h，qRT-PCR結(jié)果顯示隨著GW4869濃度的增加，細胞中miR-21的表達水

5、平逐漸升高，培養(yǎng)上清中miR-21的表達水平顯著降低，表明GW4869對外泌體miR-21的生成有抑制作用。
　　二、外泌體穿梭miR-21對細胞生物學行為的影響及其靶基因的識別
　　食管癌細胞株EC9706瞬時轉(zhuǎn)染miR-21 mimics使其過表達miR-21，應(yīng)用細胞增殖試驗（EdU法）、流式細胞技術(shù)（Annexin-Ⅴ標記）、Transwell細胞體外遷移和侵襲試驗分析過表達miR-21對食管癌細胞EC9706增殖、

6、凋亡、遷移及侵襲能力的影響。結(jié)果顯示過表達miR-21后EC9706細胞增殖能力提高、凋亡細胞數(shù)減少，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染組細胞的遷移和侵襲能力均明顯高于對照組(P＜0.05)。
　　進一步建立穩(wěn)定的供受體培養(yǎng)模型，通過轉(zhuǎn)染供體細胞使其高表達miR-21，將其與受體細胞共培養(yǎng)24h后，觀察供受體細胞間非接觸性細胞交流對受體細胞生物學功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞外泌體穿梭miR-21對受體EC970

7、6細胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲作用均有影響，轉(zhuǎn)染miR-21 mimics的腫瘤細胞外泌體能夠抑制EC9706細胞的凋亡，促進細胞的增殖、遷移和侵襲能力，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明miR-21可以通過外泌體攜帶進入受體細胞，進而促進食管癌細胞的增殖、抑制其凋亡，增加其體外遷移和侵襲能力。
　　為識別外泌體穿梭miR-21的調(diào)控機制，研究應(yīng)用生物信息學技術(shù)預(yù)測與上述生物學功能相關(guān)的miR-21調(diào)控靶基因，并

8、應(yīng)用qRT-PCR和Western Blot技術(shù)分析預(yù)測靶基因的mRNA和蛋白水平。生物信息學技術(shù)預(yù)測與細胞增殖、凋亡等多種功能相關(guān)的PDCD4是miR-21調(diào)控的靶基因之一。QRT-PCR檢測受體細胞PDCD4表達在實驗組和對照組中未見明顯差異，而Western Blot結(jié)果顯示，過表達miR-21后受體食管癌細胞中PDCD4表達較對照組降低了86.4％，提示PDCD4可能是miR-21參與食管癌細胞增殖、凋亡及侵襲等生物學行為調(diào)控的

9、靶標之一。
　　三、外泌體穿梭miR-21與食管癌發(fā)病風險的病例對照研究
　　招募67對食管癌病人和健康對照，按性別和年齡進行1∶1匹配，采集外周血，分離血漿，利用qRT-PCR的定量分析方法，以U6為內(nèi)參基因，檢測血漿中miR-21的表達水平，利用logistic回歸分析血漿miR-21表達水平與食管癌發(fā)病風險的關(guān)系。結(jié)果顯示，miR-21在病例組血漿中的表達水平較對照組高2.96倍，條件logistic回歸分析表明其表達