外泌體穿梭miR-21與食管癌發(fā)病關(guān)系研究.pdf

1、外泌體是由細(xì)胞分泌的一種納米級(jí)的囊泡狀小體，包裹著蛋白質(zhì)、mRNA、microRNAs等生物活性物質(zhì)，參與許多重要的生理、病理過(guò)程。本課題主要探討外泌體穿梭miR-21對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。研究利用可視化研究手段捕獲外泌體及其包裹的miR-21從供體細(xì)胞穿梭至受體細(xì)胞的過(guò)程，并通過(guò)系列生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，探討外泌體穿梭miR-21對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲能力的影響，及其可能的作用機(jī)

2、制。最后結(jié)合食管癌病例對(duì)照研究，分析外泌體穿梭miR-21與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。
　　一、食管癌細(xì)胞外泌體中miR-21在細(xì)胞間的傳遞
　　超速離心法提取EC9706細(xì)胞培養(yǎng)液上清中外泌體，用親脂性膜染料DiI染料熒光標(biāo)記后，應(yīng)用UltraVIEW Vox活細(xì)胞激光共聚焦顯微術(shù)追蹤觀察外泌體的運(yùn)動(dòng)?；罴?xì)胞實(shí)時(shí)成像技術(shù)顯示胞外的外泌體可以通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到活細(xì)胞內(nèi)。
　　研究進(jìn)一步應(yīng)用Cy3標(biāo)記miR-21 mimics

3、，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞EC9706，收集培養(yǎng)上清以獲得Cy3標(biāo)記的外泌體穿梭miR-21，將其加入已處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的受體細(xì)胞EC9706中分別繼續(xù)培養(yǎng)3h、6h、24h，流式細(xì)胞儀獲得受體熒光細(xì)胞的百分比即為外泌體穿梭miR-21的轉(zhuǎn)移效率，采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)受體細(xì)胞及其培養(yǎng)上清中miR-21的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，含有外泌體的培養(yǎng)上清中Cy3-miR-21 mimics在3h、6h、24h時(shí)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的效率分別為60.3％、82

4、.6％和85.0％，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染組miR-21的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，在受體細(xì)胞中平均倍數(shù)變化分別為1.49，1.41，2.08，而在受體細(xì)胞上清中分別是147.03，19.29，15.35，表明培養(yǎng)6h后大部分外泌體來(lái)源的miR-21 mimics被轉(zhuǎn)移進(jìn)入受體細(xì)胞。
　　應(yīng)用不同濃度的GW4869處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞48h，qRT-PCR結(jié)果顯示隨著GW4869濃度的增加，細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水

5、平逐漸升高，培養(yǎng)上清中miR-21的表達(dá)水平顯著降低，表明GW4869對(duì)外泌體miR-21的生成有抑制作用。
　　二、外泌體穿梭miR-21對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其靶基因的識(shí)別
　　食管癌細(xì)胞株EC9706瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-21 mimics使其過(guò)表達(dá)miR-21，應(yīng)用細(xì)胞增殖試驗(yàn)（EdU法）、流式細(xì)胞技術(shù)（Annexin-Ⅴ標(biāo)記）、Transwell細(xì)胞體外遷移和侵襲試驗(yàn)分析過(guò)表達(dá)miR-21對(duì)食管癌細(xì)胞EC9706增殖、

6、凋亡、遷移及侵襲能力的影響。結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-21后EC9706細(xì)胞增殖能力提高、凋亡細(xì)胞數(shù)減少，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　進(jìn)一步建立穩(wěn)定的供受體培養(yǎng)模型，通過(guò)轉(zhuǎn)染供體細(xì)胞使其高表達(dá)miR-21，將其與受體細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，觀察供受體細(xì)胞間非接觸性細(xì)胞交流對(duì)受體細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞外泌體穿梭miR-21對(duì)受體EC970

7、6細(xì)胞的凋亡、增殖、遷移、侵襲作用均有影響，轉(zhuǎn)染miR-21 mimics的腫瘤細(xì)胞外泌體能夠抑制EC9706細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明miR-21可以通過(guò)外泌體攜帶進(jìn)入受體細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、抑制其凋亡，增加其體外遷移和侵襲能力。
　　為識(shí)別外泌體穿梭miR-21的調(diào)控機(jī)制，研究應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)與上述生物學(xué)功能相關(guān)的miR-21調(diào)控靶基因，并

8、應(yīng)用qRT-PCR和Western Blot技術(shù)分析預(yù)測(cè)靶基因的mRNA和蛋白水平。生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)與細(xì)胞增殖、凋亡等多種功能相關(guān)的PDCD4是miR-21調(diào)控的靶基因之一。QRT-PCR檢測(cè)受體細(xì)胞PDCD4表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中未見(jiàn)明顯差異，而Western Blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-21后受體食管癌細(xì)胞中PDCD4表達(dá)較對(duì)照組降低了86.4％，提示PDCD4可能是miR-21參與食管癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲等生物學(xué)行為調(diào)控的

9、靶標(biāo)之一。
　　三、外泌體穿梭miR-21與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的病例對(duì)照研究
　　招募67對(duì)食管癌病人和健康對(duì)照，按性別和年齡進(jìn)行1∶1匹配，采集外周血，分離血漿，利用qRT-PCR的定量分析方法，以U6為內(nèi)參基因，檢測(cè)血漿中miR-21的表達(dá)水平，利用logistic回歸分析血漿miR-21表達(dá)水平與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。結(jié)果顯示，miR-21在病例組血漿中的表達(dá)水平較對(duì)照組高2.96倍，條件logistic回歸分析表明其表達(dá)