外泌體在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的研究.pdf

1、本文分為以下幾個(gè)部分:
　　第一部分:帕金森病（PD）患者以及各種PD動(dòng)物模型中血清外泌體特點(diǎn)分析
　　目的：比較PD患者與對(duì)照組人群血清來源外泌體含量差異及內(nèi)含物差別，并比較PD動(dòng)物模型外周血外泌體基本特點(diǎn)差異。
　　方法：選取患病年限>5年的原發(fā)性PD患者及年齡、性別匹配的對(duì)照組患者，留取外周血10ml，分別利用試劑盒提取法和超高速離心法提取PD病人及對(duì)照組的血清外泌體，電鏡下比較提取物形狀；Western blo

2、tting驗(yàn)證外泌體特異性標(biāo)志物CD63、TSG101表達(dá),納米顆粒跟蹤分析儀（Nanosight）比較兩組之間外泌體直徑及濃度差別。動(dòng)物模型中，將野生型雄性C57/B6J小鼠，囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體2（VMAT2）敲低C57/B6J小鼠隨機(jī)分為魚藤酮干預(yù)組（魚藤酮30mg/kg,間斷性給予灌胃2月）與未處理組;并同時(shí)向C57小鼠腹腔注射MPTP(25mg/kg,每周2次，持續(xù)5周)致PD慢性模型。向正常SD雄性大鼠大腦立體定向6-OHDA造成

3、偏側(cè)損毀模型。Nanosight對(duì)各組PD模型動(dòng)物血液中的外泌體進(jìn)行定性和定量分析。
　　結(jié)果：（1）采用超高速離心法及試劑盒提取法提取外泌體，獲得電鏡下呈杯口狀或球形物質(zhì)；試劑盒提取法所獲提取物表達(dá)含量更高；Western blotting證實(shí)提取物中含有外泌體特異性標(biāo)志物如CD63、TSG101等分子；Nanosight測(cè)量結(jié)果示提取物直徑大小主要在30-120nm之間，并利用Nanosight比較各組所得提取物濃度，結(jié)果示P

4、D患者相對(duì)于對(duì)照組人群外泌體含量增加；魚藤酮干預(yù)后小鼠外周血外泌體含量增加，且在PD易患小鼠（VMAT250％敲低小鼠）經(jīng)魚藤酮干預(yù)后更加明顯；MPTP干預(yù)小鼠較對(duì)照組小鼠外周血外泌體含量輕度增加；6-OHDA立體定向SD大鼠外周血外泌體含量較對(duì)照組明顯增加。PD病人及對(duì)照、以及各組PD模型動(dòng)物血清外泌體經(jīng)Nanosight測(cè)量粒子最大量直徑無明顯差異。
　　結(jié)論與對(duì)照組相比，部分PD動(dòng)物模型中外周血清外泌體含量增加，且PD患者外

5、周血外泌體含量增加。外泌體含量的差異有望成為反映疾病進(jìn)程及疾病診斷的標(biāo)記物。
　　第二部分:PD患者來源外泌體的致病性研究（細(xì)胞模型）
　　目的：觀察PD患者來源的血清外泌體對(duì)細(xì)胞模型的致病作用。
　　方法：抽取PD病人外周血，利用PCR法排除SNCA基因突變患者。選取原發(fā)性PD患者（PD患病年限>5年）和對(duì)照組人群各10余例，Western blotting比較兩組人群血清外泌體成分中α-突觸核蛋白（α-syn）表達(dá)

6、差異。并將PD患者和對(duì)照組人群的血清外泌體以及陽性對(duì)照魚藤酮加入SH-SY5Y細(xì)胞中，CCK-8測(cè)定細(xì)胞活力，Western blotting比較經(jīng)不同處理后細(xì)胞表達(dá)α-syn差異,免疫熒光（IF）驗(yàn)證經(jīng)不同處理后細(xì)胞病理性α-syn的沉積情況。
　　結(jié)果：PD患者與對(duì)照組人群血清來源的外泌體均含有α-syn，而α-syn寡聚體的含量在PD組明顯增多，兩組人群外泌體均無α-syn單體存在。Western blotting示PD患者

7、外泌體可引起SH-SY5Y細(xì)胞中的α-syn表達(dá)增多，IF示PD病人來源的外泌體可引起細(xì)胞中的α-syn發(fā)生聚集。
　　結(jié)論：PD患者血清來源的外泌體較對(duì)照組人群含有更多的α-syn寡聚體，并可以引起接受細(xì)胞發(fā)生寡聚化改變，最終導(dǎo)致α-syn聚集體形成。
　　第三部分:PD患者來源外泌體的致病性研究（全身注射動(dòng)物模型）
　　目的：觀察尾靜脈注射PD患者和對(duì)照組人群外泌體對(duì)不同遺傳背景小鼠的影響。方法：小動(dòng)物活體成像（I

8、VIS）驗(yàn)證外泌體血腦屏障通透性，將兩組血清外泌體經(jīng)尾靜脈注射入正常balb/c小鼠及B細(xì)胞、T細(xì)胞免疫缺陷小鼠NOD/SCID小鼠體內(nèi)3月，記錄干預(yù)前及藥物干預(yù)后小鼠體重變化情況。通過Western blotting和免疫組化或者免疫熒光觀察中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（TH）、α-syn、p-syn（ser129）、泛素、P62表達(dá)變化，HE染色觀察中腦黑質(zhì)區(qū)域路易小體形成。爬桿實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)等觀察小鼠行為學(xué)變化。
　　結(jié)果：IVIS

9、示外泌體可通過血腦屏障。給予PD外泌體干預(yù)后，小鼠體重相比對(duì)照組，出現(xiàn)輕度下降，Western blotting、免疫組化及免疫熒光等結(jié)果示野生型balb/c及NOD/SCID小鼠中腦黑質(zhì)均出現(xiàn)TH表達(dá)降低，α-syn、p-syn（ser129）表達(dá)升高，HE染色示中腦黑質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)胞體變形，細(xì)胞核深染等情況。爬桿實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)提示小鼠出現(xiàn)輕度運(yùn)動(dòng)遲緩。
　　結(jié)論：尾靜脈注射PD外泌體，能夠誘發(fā)正常balb/c和免疫缺陷N

10、OD/SCID小鼠出現(xiàn)PD病理性和行為學(xué)改變。
　　第四部分:PD患者來源外泌體的致病性研究（立體定向注射動(dòng)物模型）
　　目的：觀察紋狀體立體定向注射PD患者外泌體后對(duì)小鼠PD發(fā)病過程的影響。
　　方法：將正常balb/c小鼠顱內(nèi)置管，間斷性經(jīng)紋狀體立體定向分別注射PD患者外泌體2月,Western blotting、免疫組化或者免疫熒光觀察中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶（TH）、α-syn、p-syn（ser129）、泛素、P

11、62、IL-1β、IBA-1等表達(dá)變化，HE染色觀察中腦黑質(zhì)區(qū)域路易小體形成。高效液相色譜分析（HPLC）觀察紋狀體多巴胺（DA）及其代謝產(chǎn)物變化。爬桿實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)等觀察小鼠行為學(xué)變化。阿樸嗎啡皮下注射觀察有無誘導(dǎo)出旋轉(zhuǎn)行為。
　　結(jié)果：Western blotting、免疫組化，及免疫熒光等結(jié)果示立體定向注射PD外泌體2月后出現(xiàn)TH表達(dá)降低，α-syn、p-syn（ser129）表達(dá)升高，并且泛素、P62、IL-1β、IBA-