G蛋白偶聯(lián)受體激酶5在帕金森病模型中的表達(dá)及其在帕金森病中的作用研究.pdf

1、帕金森病是一種神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病。以震顫、僵直、姿勢(shì)平衡障礙和運(yùn)動(dòng)功能障礙為臨床特點(diǎn)，并且以黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元消失以及殘存的黑質(zhì)多巴胺細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)路易小體（Lewybodies，LBs）小體為病理特點(diǎn)。GRKs（Gprotein-coupledreceptorkinases）是G蛋白偶聯(lián)受體激酶，主要的功能是對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體（Gprotein-coupledreceptor，GPCRs）進(jìn)行磷酸化，從而介導(dǎo)

2、GPCR的脫敏反應(yīng)。GPCR被磷酸化后，抑制樣蛋白（Betaarrestins）與其結(jié)合，使其與G蛋白脫偶聯(lián)并發(fā)生內(nèi)吞，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而GRKs除了具有通過(guò)GPCR發(fā)揮G蛋白偶聯(lián)受體激酶的作用外，最近發(fā)現(xiàn)GRKs同時(shí)存在有一些非受體底物，如tubulin，synucleins和核蛋白體P2蛋白等。最近ShigekiArawaka等人發(fā)現(xiàn)在路易小體中存在有GRKs家族的GRK5蛋白。而且通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GRK5與α-Sy

3、nuclein存在共定位，并有力地證明了GRK5可以對(duì)α-Synuclein的第129位絲氨酸進(jìn)行磷酸化。我們通過(guò)建立過(guò)表達(dá)α-Synuclein的帕金森病細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，研究GRK5在帕金森病中的表達(dá)變化以及GRK5在帕金森病中的可能作用，為發(fā)現(xiàn)帕金森病的發(fā)病機(jī)制和探索更好的治療方法提供新的方向。
　　 本研究主要包括以下兩個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：
　　 1帕金森病α-Synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠和細(xì)胞模型中G蛋白偶聯(lián)受

4、體激酶5的表達(dá)以及亞細(xì)胞水平的GRK5蛋白表達(dá)變化：采用免疫印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)具有不同的人α-Synuclein（ha-syn）表達(dá)水平的帕金森病α-Synuclein轉(zhuǎn)基因模型小鼠以及3月齡、6月齡和9月齡人α-Synuclein野生型高表達(dá)組轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織進(jìn)行GRK5的RNA和蛋白水平檢測(cè)，與同窩陰性對(duì)照小鼠進(jìn)行比較。同時(shí)在建立的α-Synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中進(jìn)行GRK5的表達(dá)水平檢測(cè)并采用免疫熒光技術(shù)觀察GR

5、K5蛋白的亞細(xì)胞水平表達(dá)變化。研究結(jié)果顯示，GRK5蛋白的表達(dá)水平隨著α-Synuclein的表達(dá)升高而升高，并且發(fā)現(xiàn)GRK5蛋白在過(guò)表達(dá)α-Synuclein的細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織中的細(xì)胞核以及細(xì)胞漿內(nèi)均表達(dá)增加。
　　 2G蛋白偶聯(lián)受體激酶5的胞漿內(nèi)以及胞核內(nèi)功能研究：應(yīng)用免疫印跡技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、HDAC活性檢測(cè)技術(shù)、染色體免疫共沉淀技術(shù)以及shRNA干擾技術(shù)對(duì)α-Synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和人α-Syn

6、uclein野生型高表達(dá)組轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織增高的胞漿以及胞核內(nèi)GRK5蛋白的功能進(jìn)行研究。研究結(jié)果顯示，胞漿中的GRK5蛋白具有除磷酸化α-Synuclein129位絲氨酸以外的其他作用，胞核中的GRK5蛋白通過(guò)影響組蛋白去乙?；傅幕钚詫?duì)be12基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。
　　 綜上所述，帕金森病中GRK5的表達(dá)增加可能通過(guò)增加組蛋白去乙酰化酶活性抑制凋亡相關(guān)基因bc12的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)發(fā)揮作用。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于充分理解GRK5的功能