CDK5磷酸化Raf激酶抑制蛋白在帕金森病中的研究進展.pdf

1、隨著人口老齡化的加重,神經(jīng)退行性疾病得到了越來越多的重視。在包括阿爾茲海默式癥(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)及亨廷頓病(Huntinton’s disease,HD)等的多種神經(jīng)退行性疾病中,神經(jīng)元的過度死亡是疾病的共同表現(xiàn),也是出現(xiàn)多種神經(jīng)系統(tǒng)病理癥狀的主要原因。神經(jīng)退行性疾病中關于神經(jīng)元死亡增多的機制研究已經(jīng)獲得了一些結(jié)論,但在分子機制方面仍有許多問題尚未得

2、到回答。在研究神經(jīng)元死亡機制的過程中,神經(jīng)元細胞周期再進入(cell cycle re-entry)這一概念的重要性逐漸浮現(xiàn)出來。細胞周期是可分裂細胞維持其生長與增殖狀態(tài)的重要生理事件,但成熟神經(jīng)元是無法進入細胞周期的。當神經(jīng)元在病理狀態(tài)下進入了細胞周期時,即被稱為細胞周期再進入。神經(jīng)元無法通過細胞周期來進行分裂,因此細胞周期再進入后可直接通過凋亡相關的分子機制來介導神經(jīng)元發(fā)生死亡。
　　細胞周期的運行受到多條信號通路的調(diào)控,而絲

3、裂原激活的激酶信號通路(ERK/MAPK cascade)是其中的重要部分。在可增殖細胞中,ERK/MAPK通路主要介導了細胞由G1期進入S期以及紡錘體形成等過程;而對神經(jīng)元來說,進入S期即代表發(fā)生了細胞周期再進入,細胞會難以避免地走向死亡。因此,研究ERK/MAPK通路的活性調(diào)控對研究神經(jīng)元的細胞周期及死亡是具有重要意義的。
　　在關注ERK通路活性時,我們將Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor prot

4、ein,RKIP)作為目的分子,后者是ERK通路的生理性抑制因子,通過結(jié)合并抑制Raf-1活性來發(fā)揮作用。RKIP表達的下調(diào)已被證實參與多種惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程,但其下調(diào)的分子機制尚不明確。RKIP在腦組織中高表達,但在神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)退行性疾病中的作用也報道不多。
　　為了研究RKIP蛋白影響ERK通路活性的方式,我們又注意到另一個重要分子,細胞周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5

5、)。CDK5的活性呈神經(jīng)系統(tǒng)特異性分布,通過磷酸化多種底物來調(diào)控神經(jīng)元的發(fā)育、軸突導向、突觸形成、遷移等多種重要事件。因此,本論文擬以帕金森病為神經(jīng)退行性疾病模型,研究在其病變過程中,CDK5對RKIP蛋白是否存在調(diào)節(jié)作用,以及該調(diào)節(jié)機制是否對ERK/MAPK通路的活性和多巴胺能神經(jīng)元存活的情況產(chǎn)生影響。
　　本文首先在體外和細胞水平驗證了RKIP蛋白是CDK5的磷酸化底物,且磷酸化RKIP與Raf-1的結(jié)合能力顯著低于未磷酸化時

6、,表明RKIP的T42位磷酸化可介導RKIP與Raf-1解離。一方面,磷酸化修飾可以誘導RKIP蛋白自身通過分子伴侶介導的自噬途徑(chaperone-mediated autophagy,CMA)降解,且RKIP序列中的“179KLYEQ183”結(jié)構域是CMA的作用靶點,由分子伴侶Hsc70識別并結(jié)合該結(jié)構域,并將RKIP攜帶至溶酶體進行降解。另一方面,在與磷酸化RKIP解離后,Raf-1的激酶活性得到解放,對神經(jīng)元的檢測表明此時磷酸

7、化MEK、磷酸化ERK的表達都上調(diào),說明ERK通路下游信號出現(xiàn)了級聯(lián)式激活,并最終會產(chǎn)生細胞學效應。
　　接下來,實驗結(jié)果表明ERK通路激活時,進入S期的神經(jīng)元數(shù)量增多,表明出現(xiàn)了細胞周期再進入現(xiàn)象。此時,神經(jīng)元也出現(xiàn)了死亡增多,而抑制CDK5活性或ERK通路活性均對神經(jīng)元有保護作用,表明細胞周期再進入現(xiàn)象參與介導了神經(jīng)元的死亡。在帕金森病的神經(jīng)元模型中,我們同樣發(fā)現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元也會出現(xiàn)RKIP磷酸化增強、ERK通路激活相關的細

8、胞周期再進入,以及繼發(fā)的神經(jīng)元死亡。最后,無論是MPTP誘導的還是轉(zhuǎn)基因的帕金森病模型鼠,其中腦組織都出現(xiàn)了RKIP磷酸化水平上調(diào),ERK通路過度激活,且在老年PD鼠中存在明顯的RKIP水平降低。這些結(jié)果表明,RKIP磷酸化介導的ERK通路激活導致了多巴胺能神經(jīng)元細胞周期再進入,并參與了神經(jīng)元死亡的過程。
　　帕金森病中神經(jīng)元的死亡機制一直受到關注,而此處我們以RKIP這一分子為線索,將CDK5激酶、ERK/MAPK通路、自噬途徑