蛋白磷酸酯酶2A的酪氨酸磷酸化修飾在Alzheimer病發(fā)病中的作用.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s Disease，AD）是最常見(jiàn)的癡呆癥之一,研究并闡明AD的病因和發(fā)病機(jī)制,具有重要的社會(huì)意義和科學(xué)價(jià)值。神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillary Tangles，NFT)是AD的特征性病理學(xué)改變之一，與AD的臨床癡呆嚴(yán)重程度正相關(guān)。NFT的主要成分為成對(duì)螺旋絲(Paired Helical Filaments，PHF)，由異常過(guò)度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau組成。Tau的異常磷酸化使其喪失促微

2、管組裝和穩(wěn)定微管的功能,在AD的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。作為一種磷蛋白,tau的磷酸化程度由相關(guān)的蛋白激酶/蛋白磷酸酯酶共同作用決定,在眾多參與tau磷酸化修飾調(diào)節(jié)的酶中,蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)活性下調(diào)在tau蛋白異常過(guò)度磷酸化中起關(guān)鍵作用，然而PP2A活性下調(diào)的原因和機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。有報(bào)道在體外實(shí)驗(yàn)中，PP2A催化亞單位（PP2Ac）酪氨酸307（Y307）位點(diǎn)的磷酸化可使PP2A活性顯著下降。但是對(duì)AD病人腦內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)PP2A

3、c（Y307）位點(diǎn)的磷酸化修飾以及其與PP2A活性和AD發(fā)病的關(guān)系，目前尚未見(jiàn)任何報(bào)道。 本研究中，采用特異性針對(duì)Y307位點(diǎn)磷酸化的PP2A的抗體，通過(guò)免疫組化，激光共聚焦，免疫印跡等方法，系統(tǒng)研究了AD腦內(nèi)PP2A的酪氨酸磷酸化修飾及其與AD相關(guān)病變和可能危險(xiǎn)因子如淀粉樣蛋白Aβ沉積，雌激素缺乏和鋅離子聚集等之間的關(guān)系。其結(jié)果如下: (1) AD腦內(nèi)PP2A的酪氨酸磷酸化修飾:免疫組化和激光共聚焦研究結(jié)果顯示，酪氨酸3

4、07磷酸化的PP2A(PP2Ac-Yp307)在AD易感腦區(qū)如內(nèi)嗅皮質(zhì)、海馬等異常聚集于已有神經(jīng)原纖維纏結(jié)和即將發(fā)生神經(jīng)原纏結(jié)的神經(jīng)元，且Yp307磷酸化的PP2Ac與磷酸化的tau蛋白共定位，二者的磷酸化水平呈正相關(guān)。 (2) Aβ沉積與PP2Ac（Y307）位點(diǎn)的磷酸化修飾的關(guān)系：(i) 在穩(wěn)定表達(dá)人類瑞典突變的淀粉樣前體蛋白(APPswe)的小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞（N2a）中，tau發(fā)生過(guò)度磷酸化，同時(shí)，PP2Ac-Yp307的水

5、平增高；(ii) 同樣的改變也見(jiàn)于APPswe/ presenilin(PS1，A246E)轉(zhuǎn)基因鼠腦中；(iii) 用Aβ25-35處理野生型N2a細(xì)胞，可模擬N2a APPswe細(xì)胞內(nèi)tau和PP2Ac-Yp307的改變。 (3)在雌激素受體α或β(ERα or ERβ)基因敲除的小鼠腦內(nèi)，PP2Ac-Yp307和tau的磷酸化水平同時(shí)升高。(4)用硫酸鋅處理培養(yǎng)的野生型N2a細(xì)胞和大鼠腦組織活片，PP2Ac-Yp307和ta

6、u的磷酸化水平升高，PP2A活性下降。本研究結(jié)果顯示：在AD腦內(nèi)，酪氨酸307（Y307）位點(diǎn)的磷酸化可能是PP2A活性下調(diào)的重要原因，Aβ沉積，雌激素缺乏或鋅離子沉積可能通過(guò)上調(diào)PP2A的酪氨酸（Y307）磷酸化使得PP2A活性下調(diào)，促進(jìn)tau蛋白過(guò)度磷酸化，最終參與神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成。 第一部分:蛋白磷酸酯酶2A的酪氨酸磷酸化在阿爾茨海默病神經(jīng)元纖維纏結(jié)形成中的作用。 蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)活性下調(diào)在阿爾茨海

7、默病(AD) tau蛋白異常過(guò)度磷酸化中起關(guān)鍵作用，然而PP2A活性下調(diào)的原因和機(jī)制還未闡明。有報(bào)道在體外實(shí)驗(yàn)中，PP2A催化亞單位（PP2Ac）酪氨酸307（Y307）位點(diǎn)的磷酸化可使PP2A活性顯著下降。本研究中，采用特異性針對(duì)Y307位點(diǎn)磷酸化的PP2A的抗體，系統(tǒng)研究了AD腦內(nèi)PP2A的酪氨酸磷酸化修飾及其與AD相關(guān)病變?nèi)绲矸蹣拥鞍譇β沉積和雌激素缺乏的關(guān)系。 (1) 免疫組化和激光共聚焦研究結(jié)果顯示：酪氨酸307磷酸化的

8、PP2A(PP2Ac-Yp307)在AD易感腦區(qū)如內(nèi)嗅皮質(zhì)、海馬等異常聚集于已有神經(jīng)原纖維纏結(jié)和即將發(fā)生神經(jīng)原纏結(jié)的神經(jīng)元，且Yp307磷酸化的PP2Ac與磷酸化的tau蛋白共定位，二者的磷酸化水平呈正相關(guān)。 (2)在穩(wěn)定表達(dá)人類瑞典突變的淀粉樣前體蛋白(APPswe)的小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2a)中，tau發(fā)生過(guò)度磷酸化，同時(shí)，PP2Ac-Yp307的水平增高。 (3) 同樣的改變也見(jiàn)于APPswe/ presenilin(

9、PS1，A246E)轉(zhuǎn)基因鼠腦中。 (4) 用Aβ25-35處理野生型N2a細(xì)胞，可模擬N2a APPswe細(xì)胞內(nèi)tau和PP2Ac-Yp307的改變。 (5) 在雌激素受體α或β(Erα or Erβ)基因敲除的小鼠腦內(nèi)，PP2Ac-Yp307和tau的磷酸化水平也同時(shí)升高。 本研究結(jié)果顯示：在AD腦內(nèi)，Aβ沉積或雌激素缺乏可能通過(guò)上調(diào)PP2A的酪氨酸（Y307）磷酸化使得PP2A活性下調(diào)，促進(jìn)tau蛋白過(guò)度磷酸化

10、，最終導(dǎo)致神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成。 第二部分：硫酸鋅通過(guò)下調(diào)蛋白磷酸酯酶2A的活性導(dǎo)致tau蛋白過(guò)度磷酸化。 金屬離子鋅在腦內(nèi)的水平增高在阿爾茨海默病的神經(jīng)退行性變特別是Aβ過(guò)度沉積中起重要作用，然而對(duì)于鋅離子是否參與神經(jīng)元纖維纏結(jié)的形成和tau蛋白的過(guò)度磷酸化，以及其內(nèi)在的機(jī)制，目前還未完全闡明。 本研究中，用磷酸鋅處理體外培養(yǎng)的N2a細(xì)胞和大鼠腦組織活片，用免疫印跡法檢測(cè)tau蛋白的磷酸化水平，用酶活性測(cè)定法檢

11、測(cè)蛋白磷酸酯酶2A的活性。結(jié)果顯示：鋅處理可導(dǎo)致tau蛋白在AD腦內(nèi)異常過(guò)度磷酸化位點(diǎn)Ser396/404（PHF-1位點(diǎn)），Ser198/199/202位點(diǎn)(tau-1位點(diǎn))發(fā)生過(guò)度磷酸化，總tau的水平也增加。同時(shí)，蛋白磷酸酯酶2A（PP2A）的活性下降，失活形式的PP2A（PP2Ap(Y307)）水平增加。 結(jié)論：鋅可導(dǎo)致tau蛋白在PHF-1和tau-1位點(diǎn)發(fā)生過(guò)度磷酸化，此效應(yīng)部分由PP2A失活所介導(dǎo)。 第三部

12、分：阻斷酪氨酸蛋白激酶Src表達(dá)對(duì)蛋白磷酸酯酶2A和tau蛋白磷酸化的影響。 目的：研究細(xì)胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶Src對(duì)蛋白磷酸酯酶2A（PP2A）酪氨酸307位點(diǎn)(Y307)磷酸化和活性以及tau蛋白磷酸化的影響，為AD腦內(nèi)PP2A活性下調(diào)和Tau蛋白異常磷酸化的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：體外培養(yǎng)小鼠成神經(jīng)瘤N2a細(xì)胞，轉(zhuǎn)染特異性阻斷Src表達(dá)的SiRNA降低Src蛋白的水平，檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同時(shí)間點(diǎn)PP2A Y307的磷酸化水