鐵在α-突觸核蛋白磷酸化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種常見的多發(fā)于中老年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。主要臨床表現(xiàn)包括靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、肌僵直和姿勢步態(tài)障礙等。其主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)（substantia nigra，SN）多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元的變性死亡以及路易小體形成。目前，PD的確切病因仍未完全明了，包括遺傳因素、環(huán)境因素和老化因素。氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙、凋亡、蛋白異常聚集、鐵的過度沉積等均可

2、能參與了 PD的發(fā)病過程。α-突觸核蛋白是PD特征性病理標(biāo)志路易小體的主要成分，與家族性及散發(fā)性的PD有密切聯(lián)系，其異常聚集被認(rèn)為是 PD發(fā)病的核心機(jī)制。α-突觸核蛋白的翻譯后修飾有多種形式，如磷酸化、泛素化、糖基化、硝基化等，其中蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能最常見的，也是最重要的翻譯后修飾方式。在生理?xiàng)l件下，大鼠體內(nèi)約有4％的α-突觸核蛋白處于第129位絲氨酸位點(diǎn)（Sl29）磷酸化狀態(tài)，但在路易小體中有90％的α-突觸核蛋白Sl29被

3、磷酸化。α-突觸核蛋白的磷酸化狀態(tài)很明顯可以影響其表達(dá)和聚集，磷酸化與α-突觸核蛋白的清除機(jī)制相關(guān)。一些研究顯示α-突觸核蛋白 Sl29磷酸化（pS129）促進(jìn)包涵體形成，而另一些研究顯示磷酸化作為代償反應(yīng)抑制包涵體形成或根本不起作用。因此，α-突觸核蛋白的磷酸化對于其表達(dá)和聚集起到促進(jìn)還是抑制作用，尚未明確。尸檢表明，PD病人的黑質(zhì)區(qū)鐵含量明顯上升，且黑質(zhì)鐵的水平與PD的進(jìn)程相關(guān)，鐵的過度沉積可能是 PD發(fā)病中的關(guān)鍵因素。異常增加的鐵

4、水平促進(jìn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生從而對DA能神經(jīng)元造成損傷。前期研究證實(shí)鐵可誘導(dǎo)α-突觸核蛋白的表達(dá)及聚集，但該過程是否與α-突觸核蛋白的磷酸化有關(guān)尚不明確。Polo樣激酶2（polo-like kinase2，PLK2）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能特異性地磷酸化α-突觸核蛋白S129。酪蛋白激酶2（casein kinase2，CK2）是一種常見的含兩個(gè)α或α’催化亞基與兩個(gè)β調(diào)節(jié)亞基的絲

5、氨酸/蘇氨酸激酶。鐵作用于α-突觸核蛋白的磷酸化過程中是否有這兩種激酶的參與也尚不明確。本研究在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤 SH-SY5Y細(xì)胞上，應(yīng)用免疫印跡方法檢測了枸櫞酸鐵銨（ferric ammonium citrate，F(xiàn)AC）處理后，α-突觸核蛋白表達(dá)水平及磷酸化水平，PLK2和CK2表達(dá)水平，以及自噬標(biāo)志物L(fēng)C3表達(dá)變化。用蛋白酶體活性檢測試劑盒檢測 FAC對細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性的影響。用 PLK2的抑制劑 BI2536、CK2的抑制劑T

6、BCA以及抗氧化劑N-乙?；?L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）預(yù)處理后，檢測鐵對上述指標(biāo)影響的變化，以闡明鐵在α-突觸核蛋白磷酸化中的作用及機(jī)制。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴1mmol/L FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h，α-突觸核蛋白表達(dá)水平于12 h開始增加，1mmol/L FAC處理12 h~48 h后α-突觸核蛋白表達(dá)水平分別增加8

7、1%、90%、93%、66%、51%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果提示，鐵能夠誘導(dǎo)α-突觸核蛋白表達(dá)隨時(shí)間變化逐漸上調(diào)，隨后表達(dá)上調(diào)的程度有所減弱。⑵1mmol/L FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h，pS129表達(dá)水平于12 h開始增加，1mmol/L FAC處理12 h~48 h后pS129表達(dá)水平分別增加115%、127%、152%、106%、68%

8、，與對照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。α-突觸核蛋白的磷酸化水平于16 h開始增加，1mmol/L FAC處理16 h~48 h后pS129與α-突觸核蛋白的比值分別增加42%、42%、47%、51%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果提示，鐵能夠誘導(dǎo)α-突觸核蛋白的磷酸化水平隨時(shí)間變化逐漸上調(diào)。⑶1mmol/L FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、48 h，

9、PLK2表達(dá)于12 h開始增加，1mmol/L FAC處理12 h~48 h后PLK2表達(dá)水平分別增加33%、30%、53%、44%、35%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；CK2表達(dá)于24 h開始增加，1mmol/L FAC處理24 h與48 h后CK2表達(dá)水平分別增加46%與48%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果提示，鐵能夠誘導(dǎo)PLK2和CK2表達(dá)隨時(shí)間變化逐漸上調(diào)，PLK2表達(dá)上調(diào)的程度隨后有

10、所減弱，CK2的上調(diào)明顯晚于PLK2。⑷20μmol/L TBCA、1μmol/L BI2536、20μmol/L TBCA與1μmol/L BI2536分別預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞30min后與1 mmol/L FAC共孵育24 h，α-突觸核蛋白表達(dá)水平分別降低43%、44%、41%，與FAC組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；α-突觸核蛋白的磷酸化水平分別降低27%、31%、32%，與FAC組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.

11、01）。結(jié)果提示，CK2和PLK2的抑制劑可阻斷高鐵誘導(dǎo)的α-突觸核蛋白的磷酸化水平及表達(dá)水平增加。⑸20μmol/L TBCA處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，PLK2表達(dá)水平增加41%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。1μmol/L BI2536處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，與對照組相比，CK2表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。結(jié)果提示，細(xì)胞內(nèi)CK2的活性變化會影響 PLK2的表達(dá)，作用于同一靶點(diǎn)的不同激酶之間存在相互影響。

12、⑹0.5 mmol/LNAC預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞30min后與1 mmol/L FAC共孵育24 h，PLK2與CK2的蛋白表達(dá)水平以及α-突觸核蛋白的磷酸化水平回到正常，與FAC組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。然而NAC和FAC共孵育24 h后α-突觸核蛋白表達(dá)水平仍比對照組高出32%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果提示，抗氧化劑NAC能夠完全阻斷高鐵誘導(dǎo)的PLK2和CK2表達(dá)水平以及α-突觸核蛋白磷酸化水平上調(diào)

13、，僅部分阻斷高鐵誘導(dǎo)的α-突觸核蛋白表達(dá)上調(diào)。⑺1mmol/L FAC處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ比值和蛋白酶體活性分別增加147%和12%，與對照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。0.5 mmol/L NAC預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞30min后與1 mmol/L FAC共孵育24 h，LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值下調(diào)22%，與FAC組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；蛋白酶體活性與FAC組相比下調(diào)5