Tau蛋白磷酸化對抗細胞凋亡及其機制的研究.pdf

1、第一部分
　　 神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)是阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)和tau 相關(guān)疾病患者腦中典型的病理學(xué)特征之一，NFTs的主要成分是異常過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau。AD和tau 相關(guān)疾病患者腦內(nèi)大多數(shù)含有NFTs的神經(jīng)元盡管長期持續(xù)處在促凋亡的環(huán)境中卻不發(fā)生凋亡而是進行慢性的退行性變性死亡，目前對此現(xiàn)象的機制仍不清楚。
　　 本研究

2、在兩種細胞株鼠成神經(jīng)瘤(mouse Neuroblastoma 2a，N2a)細胞和人胚腎(Human Embryonic Kidney 293,HEK293)細胞、大鼠和tau 轉(zhuǎn)基因小鼠中探討神經(jīng)細胞逃逸凋亡及其機制。結(jié)果顯示：(1)細胞中過度表達微管相關(guān)蛋白tau 顯著抵抗凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細胞凋亡，并且同時伴隨有微管相關(guān)蛋白tau的過度磷酸化和糖原合酶激酶-3 (glycogensynthase kinase 3，GSK-3)的酶

3、活性升高；(2)在過度表達微管相關(guān)蛋白tau的細胞中過度表達GSK-3 不僅完全抑制了GSK-3的促凋亡作用，并且使細胞抵抗凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細胞凋亡；(3)細胞、大鼠和tau 轉(zhuǎn)基因小鼠中過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau與caspase-3 活性片段和(或)濃縮/碎裂的細胞核不存在共定位，去磷酸化的tau蛋白與caspase-3 活性片段和(或)濃縮/碎裂的細胞核存在共定位；(4)與微管相關(guān)蛋白tau過度磷酸化相伴隨的是Β-catenin

4、的磷酸化水平降低、Β-catenin的水平升高和細胞核轉(zhuǎn)位增加；(5)采用siRNA 方法降低?-catenin的水平顯著降低微管相關(guān)蛋白tau的抗凋亡作用；Β-catenin的過度表達抗凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細胞凋亡。綜上所述，本實驗獨創(chuàng)地提出了微管相關(guān)蛋白tau過度磷酸化的抗凋亡作用：tau蛋白過度磷酸化抑制GSK-3Β 對Β-catenin的磷酸化、升高?-catenin的水平和促進?-catenin的細胞核轉(zhuǎn)位從而使細胞抵抗凋亡。本研

5、究結(jié)果顯示微管相關(guān)蛋白tau過度磷酸化使細胞逃逸滅絕性的凋亡性死亡，為揭示AD和tau 相關(guān)疾病患者腦中神經(jīng)退行性變性的本質(zhì)提供了實驗證據(jù)。
　　 第二部分
　　 神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)是阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)的特征性病理學(xué)特征之一，NFTs 主要是由成對的螺旋絲(paired helicalfilaments，PHF)組成，而構(gòu)成P

6、HF的主要蛋白組分是過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau。另外，異常過度磷酸化的神經(jīng)細絲也是NFTs的組成成分。研究顯示W(wǎng)nt 信號途徑在AD的發(fā)病中起著重要的作用，并且過度表達dishevelled-1 (DVL-1)蛋白可以模擬Wnt 信號。目前，DVL-1蛋白對神經(jīng)細絲磷酸化的影響以及對神經(jīng)細胞中微管相關(guān)蛋白tau 磷酸化的影響尚未見報道。在本實驗中，為了探討DVL-1蛋白對阿爾茨海默病樣骨架蛋白磷酸化的影響，首先，用渥曼青霉素處理鼠成

7、神經(jīng)瘤細胞 2a(mouse Neuroblastoma 2a，N2a)建立細胞骨架蛋白異常過度磷酸化的細胞模型；然后，在N2a 細胞中轉(zhuǎn)染攜帶DVL-1基因的真核表達質(zhì)粒過度表達DVL-1蛋白，用渥曼青霉素處理細胞后，采用免疫印跡和免疫熒光技術(shù)檢測神經(jīng)細絲和微管相關(guān)蛋白tau的磷酸化。結(jié)果顯示：神經(jīng)細絲在SMI31 位點和tau蛋白在PHF-1 位點的磷酸化在渥曼青霉素處理后1 h和3 h 增強，6 h 恢復(fù)至正常水平；神經(jīng)細絲和微管

8、相關(guān)蛋白tau 磷酸化的高峰分別在渥曼青霉素處理后1 h和3 h ；過度表達DVL-1蛋白顯著抑制渥曼青霉素誘導(dǎo)的神經(jīng)細絲在SMI31和SMI32 位點和微管相關(guān)蛋白tau在PHF-1 (Ser-396/404)、M4 (Thr-231/Ser-235)和Tau-1 (Ser-198/199/202)位點的過度磷酸化。綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)：在N2a 細胞中過度表達DVL-1蛋白能夠顯著抑制渥曼青霉素誘導(dǎo)的神經(jīng)細絲和微管相關(guān)蛋白tau

9、的過度磷酸化。
　　 第三部分
　　 目的：將鼠dishevelled-1 (DVL-1)cDNA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的鼠成神經(jīng)瘤細胞N2a (mouse Neuroblastoma 2a)，建立瞬時表達系統(tǒng)，為研究Wnt 信號途徑在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)發(fā)病中的作用提供實驗基礎(chǔ)。方法：用常規(guī)分子生物學(xué)方法擴增和純化DVL-1 cDNA 重組質(zhì)粒，用紫外分光技術(shù)檢測純化質(zhì)粒的純度；用

10、脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)的鼠成神經(jīng)瘤細胞N2a，用免疫印跡和免疫熒光方法從蛋白質(zhì)水平檢測轉(zhuǎn)染和表達效果。結(jié)果：質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果顯示：鼠DVL-1 cDNA 重組質(zhì)粒PCS2+MT-MDVL1 擴增和純化成功，純度達到要求；免疫印跡和免疫熒光結(jié)果顯示鼠DVL-1 cDNA 重組質(zhì)粒在鼠成神經(jīng)瘤細胞N2a 中獲得表達，基因轉(zhuǎn)染和表達率為57.6[％]。結(jié)論：成功將鼠DVL-1 cDNA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的鼠成神經(jīng)瘤細胞N2a 中，