Toll樣受體4激活對異常磷酸化Tau蛋白的調節(jié)及其機制研究.pdf

1、第一部分神經炎癥對小鼠腦內自噬水平的調控及作用機制
　　目的：本部分實驗分別從生理及病理情況下誘導神經炎癥，通過自噬相關標記物的測定研究神經炎癥對小鼠腦內自噬水平的調控及作用機制。
　　方法：在體實驗分別構建了在腦內骨髓系細胞中特異性敲除 ikbkb基因的老年小鼠（18月齡）；以及在腦內髓細胞系中特異性敲除ikbkb，mapk14和myd88基因的年輕小鼠（3月齡），取同窩生的野生型小鼠作為對照。以細菌脂多糖（lipopol

2、ysaccharide，LPS）作為誘導病理情況下神經炎癥的工具藥。分別給予3月齡及18月齡C57BL6J野生型小鼠每隔兩天一次的LPS（1mg/kg）腹腔注射，并持續(xù)注射1周，總共4次，并取同窩生的野生型小鼠注射PBS作為對照；用同樣的方法處理腦內髓細胞系中特異性敲除ikbkb，mapk14和myd88基因的小鼠。熒光定量PCR檢測小鼠腦內炎癥因子tnf-?、l-1?及mcp-1的mRNA轉錄水平；Western blotting方法

3、在蛋白水平檢測腦內自噬相關蛋白 LC3B，Beclin1和 p62的表達量；分別使用Western blotting方法和組織免疫熒光標記的方法檢測腦內海馬區(qū)的Iba1蛋白的表達量及 Iba1陽性細胞數。離體實驗構建了骨髓源性巨噬細胞與轉染了自噬重組質粒的SH-SY5Y細胞共培養(yǎng)的觀測體系，激光共聚焦觀察經不同濃度、時間點處理后神經細胞內mRFP-GFP-LC3點狀聚集情況。
　　結果：
　　1.衰老誘導的神經炎癥對小鼠腦內

4、自噬水平的影響：在腦內骨髓系細胞中特異性敲除IKK?蛋白的老年小鼠的神經炎癥水平下調，自噬相關蛋白的表達同時出現下降。
　　2.小膠質細胞 Toll樣受體4激活對小鼠腦內自噬水平的影響：1）與接受 PBS注射的對照組相比，接受LPS注射的小鼠（3月齡及18月齡）腦內小膠質細胞炎性激活，腦內炎癥因子tnf-?和 il-1?的mRNA轉錄水平顯著升高，同時自噬相關蛋白LC3B，Beclin1表達水平升高，在老年小鼠中，LPS誘導LC3

5、B-II增加的比率較年輕小鼠更多。2）與髓細胞內表達IKK?,p38?-MAPK和MyD88蛋白正常的小鼠相比，相應基因敲除的小鼠在接受 LPS注射后神經炎癥水平有顯著變化，而該變化與腦內自噬水平的變化一致。3）激光共聚焦觀察轉染了mRFP-GFP-LC3的SH-SY5Y細胞內GFP、RFP點狀聚集在接受了巨噬細胞共培養(yǎng)條件下的LPS刺激后顯著增加，該效果呈劑量依賴性地增強。
　　結論：（1）衰老誘導的神經炎癥與小鼠腦內自噬水平增

6、加相關（2）LPS誘導的神經炎癥與不同年齡小鼠腦內自噬水平增加相關。（3）接受 LPS處理后，不同炎癥相關基因敲除小鼠的神經炎癥變化水平與腦內自噬變化水平相關。（4）LPS誘導的髓細胞性炎癥引起SH-SY5Y報告細胞自噬上調。本實驗為探討生理及病理不同情況下的神經炎癥對神經自噬的影響提供了實驗基礎。
　　第二部分長期低水平誘導的Toll樣受體4激活通過自噬溶酶體途徑降解異常磷酸化Tau蛋白
　　目的：本部分實驗觀察低水平長期

7、 TLR4激活誘導下的神經炎癥對神經元自噬水平的影響，以及該處理對Tau轉基因小鼠腦內異常磷酸化Tau蛋白的調控及其相關機制。
　　方法：在體實驗構建了過表達人源性P301S變異型微管相關Tau蛋白的轉基因AD小鼠，以細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為誘導神經炎癥的工具藥。分別給予6月齡上述轉基因小鼠每周一次LPS（0.15mg/kg）腹腔注射，持續(xù)注射12周，并取同窩生的轉基因小鼠注射PBS作為對照。

8、熒光定量PCR檢測小鼠腦內炎癥因子tnf-?、l-1?的 mRNA轉錄水平；組織免疫熒光標記的方法檢測小鼠腦內小膠質細胞及星形膠質細胞蛋白標記Iba1和S100陽性的細胞數；Western blotting方法檢測p65，ERK42/44，p38?-MAPK三種蛋白的磷酸化水平來評估該處理下的神經炎癥誘導情況。使用Western blotting方法在蛋白水平檢測腦內自噬相關蛋白 LC3B，Beclin1和p62的表達量；組織免疫熒光標

9、記的方法檢測小鼠大腦皮層內LC3A/B陽性細胞數。使用梯度萃取的方法檢測不同組分中磷酸化Tau蛋白的含量，并使用Western blotting方法半定量分析；組織免疫熒光標記的方法檢測小鼠大腦內 AT8免疫信號陽性的神經元數量。使用Western blotting方法在蛋白水平檢測腦內激酶GSK3α/β和p38-MAPK的磷酸化水平；腦組織溶酶體成分純化萃取法提取純化溶酶體，并使用Western blotting方法檢測溶酶體蛋白LA

10、MP-1、磷酸化Tau及非溶酶體成分的calnexin和?-actin的蛋白表達量；激光共聚焦觀察自噬囊泡標記物 p62及磷酸化 Tau共定位情況。使用Morris水迷宮實驗測試Tau轉基因小鼠接受不同處理后的行為學指標；組織免疫熒光標記的方法檢測小鼠大腦突觸蛋白標記物synaptophysin表達量；Western blotting方法檢測突觸結構蛋白PSD95和Munc18-1含量。離體實驗構建了人源性ATG5顯性失活突變及野生型質

11、粒轉染的SH-SY5Y細胞，Western blotting方法檢測在骨髓源性巨噬細胞共培養(yǎng)體系中，接受LPS刺激后磷酸化Tau蛋白的含量。
　　結果：
　　1.長期低水平的 TLR4激活對小鼠腦內自噬水平的影響：長期低水平的 TLR4激活增強Tau轉基因小鼠腦內自噬水平。
　　2.長期低水平的TLR4激活對Tau轉基因小鼠神經炎癥的影響：1）與接受PBS注射的對照組相比，接受LPS注射的小鼠腦內小膠質細胞蛋白標記物I

12、ba1表達增高，但通過Iba-1免疫熒光染色陽性的細胞數并未顯著增加；星形膠質細胞數量通過計數S100陽性細胞也未發(fā)現有顯著增加。2）接受LPS注射后小鼠腦內炎癥因子tnf-?和il-1?的 mRNA轉錄水平也沒有出現變化。3）炎癥相關激酶 p65，ERK42/44，p38?-MAPK三者磷酸化水平在接受LPS注射后也均未有顯著變化。4）接受LPS注射后小鼠體重無明顯下降，也并未出現免疫耐受。上述結果充分表明，長期低水平的TLR4激活不

13、會引起嚴重的神經炎癥反應。
　　3.長期低水平的TLR4激活對腦內異常磷酸化Tau蛋白的影響：與接受PBS注射的對照組相比，接受LPS注射的小鼠腦內異常磷酸化Tau蛋白含量在RIPA和甲酸組分中顯著下降；AT8免疫信號陽性的神經元數量也明顯少于PBS處理組。
　　4.長期低水平的TLR4激活對腦內異常磷酸化Tau蛋白調控機制：1）長期低水平的TLR4激活并不影響激酶GSK3α/β和p38-MAPK的磷酸化水平，提示其并不影響

14、磷酸化Tau蛋白的生成。2）長期低水平的TLR4激活促進腦內溶酶體形成，并促進異常磷酸化Tau蛋白進入溶酶體。3）自噬囊泡標記物p62及磷酸化Tau共定位提示異常磷酸化 Tau蛋白的確可以通過自噬溶酶體途徑進行降解。4）ATG5顯性失活突變SH-SY5Y細胞磷酸化Tau蛋白量在與巨噬細胞共培養(yǎng)體系中接受LPS刺激后無明顯變化，而ATG5野生型含量下降提示炎癥的確能通過自噬溶酶體途徑降解異常磷酸化Tau蛋白。
　　5.長期低水平的T

15、LR4激活對Tau轉基因小鼠AD相關癥狀的影響及機制：1）長期低水平的TLR4激活能改善Tau轉基因小鼠的空間學習記憶能力。2）長期低水平的TLR4激活能減少小鼠神經元突觸的損傷。
　　結論：（1）長期低水平的TLR4激活增強小鼠腦內自噬。（2）長期低水平的TLR4激活不引起嚴重的神經炎癥反應。（3）長期低水平的TLR4激活促進異常磷酸化Tau蛋白的降解。（4）自噬溶酶體介導了TLR4激活誘導的異常磷酸化Tau蛋白的降解。（5）長