GSK3β對(duì)Drp1磷酸化調(diào)節(jié)的機(jī)制及其功能的研究.pdf

1、線粒體的動(dòng)態(tài)平衡是指線粒體處于不斷分裂和融合的穩(wěn)態(tài)中，此過程主要受分裂蛋白Drp1、Fis1及融合蛋白MFN1/2、OPA1所調(diào)控。相關(guān)的研究證實(shí)，在神經(jīng)退行性疾病尤其是阿茲海默綜合癥(AD)及亨廷頓舞蹈癥(HD)中，神經(jīng)元的動(dòng)態(tài)平衡受損從而導(dǎo)致線粒體呈過度分裂狀態(tài)，進(jìn)而影響神經(jīng)元內(nèi)的ATP產(chǎn)生、凋亡信號(hào)的釋放并導(dǎo)致突觸功能的減退。但是，線粒體過度分裂的分子機(jī)制仍不清楚。糖原合成酶激酶3β(GSK3β)是神經(jīng)元中一種重要的激酶，廣泛參與

2、神經(jīng)元的發(fā)育、分化、凋亡等各個(gè)方面，對(duì)于神經(jīng)元正常功能的維持至關(guān)重要。近年的研究顯示，GSK3β活性的異常升高可能是導(dǎo)致AD發(fā)生的關(guān)鍵因素。而其中，GSK3β是否可以調(diào)節(jié)線粒體的動(dòng)態(tài)平衡并導(dǎo)致疾病的發(fā)生對(duì)于AD發(fā)病機(jī)制的研究具有非常重要的價(jià)值。先前的相關(guān)研究證實(shí)，真菌中GSK3β與Drp1存在蛋白間的相互作用，提示GSK3β與Drp1的相互作用可能存在于神經(jīng)元中，并可能對(duì)神經(jīng)元功能的維持發(fā)揮重要作用。
　　為了研究GSK3β能否通

3、過Drp1來調(diào)控神經(jīng)元中線粒體的動(dòng)態(tài)平衡，我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列免疫熒光及蛋白印跡的實(shí)驗(yàn)研究具體的分子機(jī)制，并建立小鼠的行為學(xué)模型觀察干預(yù)兩分子結(jié)合后對(duì)其學(xué)習(xí)與記憶能力的影響，闡明了GSK3β與Drp1的相互作用在AD發(fā)生中可能起到的作用。研究結(jié)果如下:
　　1.GSK3β活性升高促進(jìn)線粒體的分裂
　　在體外培養(yǎng)7天的神經(jīng)元中，與對(duì)照組相比，過表達(dá)GSK3β會(huì)導(dǎo)致線粒體變短，同時(shí)含有分裂狀態(tài)線粒體的神經(jīng)元比例顯著上升;而用GSK3

4、β抑制劑AR-A014418處理會(huì)導(dǎo)致線粒體變長(zhǎng)，同時(shí)含有分裂狀態(tài)線粒體的神經(jīng)元顯著下降。
　　2.Drp1參與GSK3β調(diào)控的線粒體過度分裂
　　用小干擾RNA抑制Drp1表達(dá)之后，GSK3β無法誘導(dǎo)線粒體的分裂，證明GSK3β調(diào)控線粒體分裂是依賴于Drp1的。并通過免疫共沉淀與免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　3.Drp1上40及44位絲氨酸的磷酸化控制GSK3β調(diào)控的線粒體過度分裂
　　首先用生物

5、信息學(xué)方法預(yù)測(cè)Drp1上GSK3β磷酸化的潛在位點(diǎn)，并通過分子克隆技術(shù)對(duì)分值較高的位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，模擬該位點(diǎn)持續(xù)磷酸化及持續(xù)去磷酸化的狀態(tài);然后用觀察線粒體形態(tài)的方法尋找實(shí)際的位點(diǎn)。經(jīng)過形態(tài)學(xué)的觀察，確定Drp1上40及44位的絲氨酸被GSK3β磷酸化之后，可明顯促進(jìn)線粒體的分裂。
　　4.Drp1上40及44位絲氨酸通過不同的分子機(jī)制被GSK3β磷酸化
　　為了確定兩個(gè)位點(diǎn)磷酸化的機(jī)制，首先制備了針對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)的特異性磷酸化

6、抗體并驗(yàn)證其效率;隨后用特異性磷酸化抗體確定Drp1上44位絲氨酸可被GSK3β直接磷酸化，而40位絲氨酸需要44位絲氨酸先被磷酸化為基礎(chǔ)。
　　5.Drp1磷酸化導(dǎo)致其GTPase活性升高及線粒體組分分布增加
　　通過GTPase活性檢測(cè)顯示，磷酸化Drp1相比對(duì)照組Drp1的GTPase活性顯著增加;而通過提純線粒體組分后蛋白印跡發(fā)現(xiàn)磷酸化后的Drp1大部分分布于線粒體組分中，而去磷酸化的Drp1更多的分布于胞漿中;此外

7、，二聚化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明Drp1的磷酸化對(duì)于其二聚化的形成并沒有影響。
　　6.Drp1磷酸化會(huì)導(dǎo)致線粒體過度分裂并降低ATP的產(chǎn)生和樹突脊的形成
　　形態(tài)分析實(shí)驗(yàn)證明Drp1磷酸化會(huì)導(dǎo)致線粒體過度分裂。進(jìn)一步的生化和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明Drp1磷酸化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)量降低，并影響神經(jīng)元突觸的形成。
　　7.Tat-Drp1DD阻斷GSK3β與Drp1的結(jié)合并檢測(cè)其效率
　　在之前工作的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)多肽Tat-Dr

8、p1DD干擾GSK3β與Drp1的結(jié)合，并檢測(cè)藥物處理后的Drp1磷酸化;此外，多肽處理神經(jīng)元之后可觀察到線粒體形態(tài)有一定程度的恢復(fù)。
　　8.海馬腦區(qū)注射Tat-Drp1DD可改善AD小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力
　　實(shí)驗(yàn)選取12個(gè)月左右已顯現(xiàn)癡呆癥狀的AD小鼠為研究對(duì)象，在AD小鼠腦內(nèi)注射多肽14天后，處死并取海馬腦區(qū)做蛋白印跡分析，結(jié)果顯示藥物處理后海馬腦區(qū)的Drp1磷酸化水平顯著降低。同時(shí)，小鼠腦內(nèi)caspase3活性下降，

9、突觸蛋白synaptophysin表達(dá)量回升。此外，免疫組化結(jié)果顯示小鼠腦內(nèi)的amyloidβ沉積明顯下降。
　　9.Tat-Drp1DD可降低AD小鼠海馬腦區(qū)的Drp1磷酸化水平
　　在行為學(xué)檢測(cè)中，實(shí)驗(yàn)組用Tat-Drp1DD進(jìn)行海馬腦區(qū)注射，隨后的新奇物體認(rèn)知及水迷宮的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力顯著上升。
　　結(jié)論:
　　通過分子細(xì)胞水平到動(dòng)物行為學(xué)水平的一系列實(shí)驗(yàn)，我們證