Tudor-SN蛋白磷酸化對(duì)其參與應(yīng)激顆粒形成的機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：細(xì)胞應(yīng)激是細(xì)胞處在不利生存條件下所采取的保護(hù)性的應(yīng)答方式，細(xì)胞應(yīng)激也分為多種，比如氧化應(yīng)激，病毒感染，缺氧應(yīng)激等等，對(duì)于不同的應(yīng)激，細(xì)胞內(nèi)會(huì)有不同的信號(hào)通路應(yīng)答相對(duì)應(yīng)的應(yīng)激刺激，其中應(yīng)激顆粒（SGs）的形成是細(xì)胞應(yīng)激過(guò)程中一個(gè)重要方面。Tudor-SN蛋白作為一種多功能蛋白，在細(xì)胞應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，例如在植物中，Tudor-SN蛋白可以提高植物的應(yīng)激耐受力，并可穩(wěn)定敏感的mRNA的水平，對(duì)于植物在高鹽、高滲的環(huán)境下生

2、長(zhǎng)至關(guān)重要。近年來(lái)陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道，Tudor-SN蛋白可以參與應(yīng)激顆粒的形成，并起到抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。本課題旨在通過(guò)對(duì) Tudor-SN蛋白的關(guān)鍵性磷酸化位點(diǎn)在其參與應(yīng)激顆粒形成過(guò)程中作用的研究，進(jìn)而深入探討其在應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮的重要作用。
　　方法：本課題分為三個(gè)部分，第一部分是構(gòu)建pCMV-N-Tudor-SN(T103A)-Flag、pmCherry-C1-Tudor-SN(T103A)兩種點(diǎn)突變質(zhì)粒，首先通過(guò)定點(diǎn)突

3、變技術(shù)將 T hr103(T103)位點(diǎn)進(jìn)行突變，然后利用質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)，將目的片段與載體相連接，該兩種質(zhì)?？梢詾楹罄m(xù)的CoIP及免疫熒光實(shí)驗(yàn)提供必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。第二部分是T103點(diǎn)突變對(duì)Tudor-SN蛋白參與應(yīng)激顆粒形成的影響。這部分分為三個(gè)方面，第一方面利用重組質(zhì)粒，觀察T103點(diǎn)突變后對(duì)Tudor-SN蛋白與應(yīng)激顆粒共定位的影響。第二方面，利用CoIP技術(shù)，研究點(diǎn)突變情況下，Tudor-SN蛋白與應(yīng)激顆粒蛋白組分的結(jié)合情況。第三方

4、面，利用 RIP技術(shù)，研究點(diǎn)突變情況下，Tudor-SN蛋白與應(yīng)激顆粒mRNA組分結(jié)合的情況。第三部分是應(yīng)激條件下磷酸化 Tudor-SN蛋白的上游激酶分析。此部分分為四個(gè)方面。第一方面， Tudor-SN蛋白 T103位點(diǎn)潛在激酶生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。利用磷酸化數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站對(duì)Tudor-SN蛋白的潛在激酶進(jìn)行預(yù)測(cè)。第二方面，Tudor-SN蛋白與潛在激酶的結(jié)合檢測(cè)。利用 CoIP技術(shù)檢測(cè) Tudor-SN蛋白與一些潛在激酶的結(jié)合情況。第三方面

5、，Tudor-SN蛋白潛在激酶的驗(yàn)證。利用體外激酶檢測(cè)技術(shù)，確定能夠直接磷酸化 Tudor-SN蛋白 T103位點(diǎn)的激酶。第四方面，抑制 JNK激酶活性對(duì)Tudor-SN磷酸化水平及其參與應(yīng)激顆粒形成的影響。給予JNK抑制劑的情況下，利用Western blot技術(shù)檢測(cè)T103位點(diǎn)磷酸化程度的變化，利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)Tudor-SN蛋白與應(yīng)激顆粒的共定位情況。
　　結(jié)果：
　　①兩種質(zhì)粒 pCMV-N-Tudor-SN(T

6、103A)-Flag、pmCherry-C1-Tudor-SN(T103A)能夠在細(xì)胞中融合表達(dá)，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　②Tudor-SN蛋白T103位點(diǎn)突變后，其不能與應(yīng)激顆粒共定位。
　?、跜oIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T103位點(diǎn)突變可導(dǎo)致其與顆粒組分蛋白G3BP、TIAR的結(jié)合減弱。
　　④RIP結(jié)果顯示， T103位點(diǎn)突變沒(méi)有影響其與應(yīng)激顆粒 mRNA組分AGTR1-3'UTR的影響。
　　

7、⑤Tudor-SN蛋白與其潛在磷酸化激酶JNK有結(jié)合，和激酶p38沒(méi)有結(jié)合。
　　⑥激活的JNK可以直接磷酸化Tudor-SN蛋白的T103位點(diǎn)。
　　⑦給予JNK抑制劑，可以使T103位點(diǎn)的磷酸化水平下降，且定位于應(yīng)激顆粒的T103位點(diǎn)磷酸化的Tudor-SN蛋白明顯減少。
　　結(jié)論：
　　①在亞砷酸鹽刺激條件下，Tudor-SN蛋白T103位點(diǎn)磷酸化是其能夠進(jìn)入應(yīng)激顆粒的先決條件。
　?、赥udor-S