Tudor-SN蛋白調(diào)控脂肪分化的機(jī)制及其對(duì)代謝的影響.pdf

1、目的：
　　最近的研究證實(shí)Tudor-SN蛋白在胞漿中的一些細(xì)胞器如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，脂滴中被發(fā)現(xiàn)，還有研究表明脂肪細(xì)胞穩(wěn)定性的維持需要Tudor-SN蛋白的參與，Tudor-SN蛋白在脂肪發(fā)生變性時(shí)會(huì)傾向于在LDL聚集，并且會(huì)影響磷脂蛋白的分泌。我們實(shí)驗(yàn)室前期在穩(wěn)定敲低 Tudor-SN的MDA-MB-231細(xì)胞系表達(dá)譜芯片結(jié)果中顯示，眾多與脂肪細(xì)胞分化及成熟相關(guān)的基因在Tudor-SN的表達(dá)下調(diào)后也發(fā)生了較為顯著的上調(diào)或者下調(diào)。這一結(jié)果

2、提示我們Tudor-SN可能參與了脂肪細(xì)胞的分化，后期我們通過構(gòu)建的Tudor-SN轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行的研究結(jié)果顯示，Tudor-SN有可能通過影響脂肪細(xì)胞的分化進(jìn)程進(jìn)一步影響小鼠個(gè)體水平上胰島素敏感性的變化。本課題的主要目的是在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，探討Tudor-SN在脂肪細(xì)胞分化中的作用及其可能的機(jī)制，以及對(duì)小鼠代謝水平的影響。
　　方法：
　　將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（3T3-L1）過表達(dá)Tudor-SN或者通過轉(zhuǎn)染小干擾將其敲

3、低，然后給予胰島素、地塞米松、IBMX混合刺激，利用油紅染色確定Tudor-SN的表達(dá)差異是否會(huì)影響胞內(nèi)脂滴的生成。利用 Tudor-SN knockout的MEF細(xì)胞對(duì)該結(jié)論進(jìn)行進(jìn)一步的認(rèn)定。通過western-blot及Real-time PCR驗(yàn)證Tudor-SN與PPARγ這一調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的最為重要的轉(zhuǎn)錄因子在分化過程中翻譯水平及轉(zhuǎn)錄水平的差異；利用Co-IP和GST-pull down確定兩者是否結(jié)合以及結(jié)合的具體片段；利

4、用免疫熒光觀察在分化末期兩者的共定位情況。通過蟲熒光素酶報(bào)告基因以及染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)確定在脂肪分化過程中 Tudor-SN參與的轉(zhuǎn)錄調(diào)控情況。為了確定Tudor-SN的缺失是否會(huì)影響組蛋白修飾情況的變化，我們通過western-blot檢測(cè)了正常MEF和Tudor-SN KO MEF在誘導(dǎo)分化過程中相關(guān)組蛋白去乙?；傅谋磉_(dá)變化。我們構(gòu)建了Tudor-SN轉(zhuǎn)基因（Tg）小鼠，與正常（WT）小鼠分別進(jìn)行正常飲食與高脂飲食12周的喂養(yǎng)，

5、檢測(cè)正常飲食與高脂飲食情況下兩種小鼠的體重差異以及肝臟和脂肪的重量差異。冰凍切片染色檢測(cè)肝臟的脂肪變性情況。利用血糖儀檢測(cè)高脂后WT和Tg小鼠空腹血糖的含量，糖原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)高脂后肝臟糖原的含量。生化分析儀檢測(cè)血清中的AST和ALT指標(biāo)。利用葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)和胰島素耐受實(shí)驗(yàn)反映高脂后WT和Tg小鼠胰島素的敏感性的狀況。western-blot檢測(cè)肝臟和脂肪組織以及原代肝細(xì)胞胰島素刺激后Akt的磷酸化水平，從而反映其組織的胰島素敏感性。<

6、br>　　結(jié)果：
　　Tudor-SN蛋白與脂肪細(xì)胞分化呈正相關(guān)的關(guān)系，當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)被敲除后脂肪細(xì)胞分化能夠完全被抑制。Tudor-SN與PPARγ在分化過程中蛋白水平與mRNA水平呈現(xiàn)出變化的一致性。Tudor-SN與PPARγ在細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合，這種結(jié)合通過Tudor-SN的SN結(jié)構(gòu)域完成，且在細(xì)胞內(nèi)兩者存在共定位。Tudor-SN在原代前脂肪細(xì)胞中表達(dá)，且與PPARγ結(jié)合，但在成熟的原代脂肪細(xì)胞中不表達(dá)。Tudor-SN在脂肪細(xì)

7、胞分化過程中，其轉(zhuǎn)錄活性受到 CEBP/β的調(diào)控。Tudor-SN能夠結(jié)合到PPARγ的靶基因的PPRE區(qū)，作為PPARγ的共激活因子激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。Tudor-SN的缺失能夠招募更多的組蛋白去乙?；?，從而使組蛋白的乙酰化水平降低，對(duì)轉(zhuǎn)錄起到抑制作用。Tudor-SN轉(zhuǎn)基因小鼠在高脂喂養(yǎng)的條件下體重明顯輕于野生型小鼠，表現(xiàn)出了外周脂肪重而肝臟重量輕的特點(diǎn)。且肝臟的脂肪變性要顯著輕于野生型小鼠。Tudor-SN轉(zhuǎn)基因小鼠相比于野生型