丙酮酸肌酸對(duì)肉雞脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、丙酮酸肌酸(creatine pyruvate，CrPyr)是一種新的功能營養(yǎng)素，其對(duì)丙酮酸和肌酸的生物學(xué)功能進(jìn)行了有效的結(jié)合和互補(bǔ)。丙酮酸肌酸的主要功能是抑制肌肉中蛋白質(zhì)的流失、增加肌肉重量，同時(shí)促進(jìn)脂肪代謝、減少體脂百分?jǐn)?shù)。目前，對(duì)于CrPyr功能的研究主要集中在運(yùn)動(dòng)生理學(xué)方面。其在畜禽生產(chǎn)方面，特別是對(duì)家禽脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝影響的研究鮮有報(bào)道。本研究以雄性AA肉雞為研究對(duì)象，探討日糧添加丙酮酸肌酸對(duì)內(nèi)雞脂肪代謝及蛋白質(zhì)代謝的影響

2、；并以比較蛋白質(zhì)組學(xué)為主要研究手段，構(gòu)建CrPyr處理的肉雞肝臟和肌肉組織蛋白表達(dá)譜，分析表達(dá)差異并揭示各相關(guān)蛋白質(zhì)/酶之間的作用規(guī)律和相互關(guān)系，揭示丙酮酸肌酸調(diào)節(jié)肉雞脂肪代謝及蛋白質(zhì)代謝生物化學(xué)機(jī)制。
　　 ⑴日糧添加不同劑量的丙酮酸肌酸對(duì)肉雞脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝的影響。為探討丙酮酸肌酸(CrPyr)對(duì)肉雞脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝的影響，400羽1日齡雄性AA肉雞隨機(jī)分為4組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25羽。按常規(guī)飼養(yǎng)方式飼喂至22

3、日齡，分別于基礎(chǔ)日糧中添加0％、1％、5％和10％CrPyr。飼喂至42日齡，各組分別從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抽取3只肉雞宰殺，采集血樣、肝臟、腹脂等凍存，待測(cè)。試劑盒法檢測(cè)肝臟甘油三酯(TG)、血清TG、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、非酯化脂肪酸(NEFA)和尿酸(UA)的含量及肌酸激酶(CK)的活性；放射免疫分析法檢測(cè)血清中胰高血糖素(Glucagon)、胰島素(Insulin)和瘦素

4、(Leptin)的含量；熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)肝臟組織中脂肪代謝關(guān)鍵因子乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合酶(FAS)、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-Ⅰ(CPT-Ⅰ)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)及肌肉中胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、肌肉中生肌調(diào)節(jié)因子(Myogenin)、肌肉生長抑制素(Myostatin)基因的mRNA表達(dá)水平。試驗(yàn)結(jié)果顯示，10％CrPyr顯著降低肉雞體重(BW)和日增重(ADG)。5％和10％CrP

5、yr均可以顯著降低肉雞的腹脂率(AFR)、血清及肝臟中甘油三酯(TG)含量。相反，5％和10％CrPyr顯著升高相對(duì)胸肌重量、血清中NEFA、HDL-C、Glucagon、Insulin和Leptin含量及CK活性。基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，5％和10％CrPyr可促進(jìn)肝臟PPAR-α、CPT-Ⅰ和肌肉IGF-1的mRNA表達(dá)，降低肌肉Myostatin的mRNA表達(dá)。結(jié)果提示，添加5％的CrPyr在不影響生長性能的情況下，能夠降低AA肉雞

6、脂肪的沉積，同時(shí)增強(qiáng)體蛋白的沉積。
　　 ⑵丙酮酸、丙酮酸肌酸和肌酸對(duì)肉雞脂肪代謝及蛋白質(zhì)代謝的影響。為比較丙酮酸(Pyr)、丙酮酸肌酸(CrPyr)和肌酸(Cr)對(duì)內(nèi)雞脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝的影響，400羽1日齡雄性AA肉雞隨機(jī)分為4組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)25羽。按常規(guī)飼養(yǎng)方式飼喂至22日齡，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組分別于基礎(chǔ)日糧中添加5％CrPyr、2％Pyr和3％Cr。飼喂至42日齡時(shí)，各組分別從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)隨機(jī)抽取

7、3只肉雞宰殺，采集血樣、肝臟、腹脂等凍存，待測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)同試驗(yàn)一。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5％CrPyr對(duì)肉雞的體重及飼料轉(zhuǎn)化率并無影響；CrPyr和Pyr均顯著降低肝臟TG和血清TC；CrPyr顯著升高相對(duì)腿肌重量、血清中NEFA和HDL-C的含量以及肝臟組織中CPT-Ⅰ和PPAR-α基因的mRNA表達(dá)水平；CrPyr和Cr均顯著降低血清中UA的含量和肌肉組織中Myostatin基因的mRNA表達(dá)水平，顯著升高肌肉組織中IGF-1基因的mRNA

8、表達(dá)水平。結(jié)果提示，CrPyr在降低肉雞的脂肪代謝沉積和增強(qiáng)蛋白質(zhì)沉積方面均強(qiáng)于Pyr和Cr，體現(xiàn)了其雙功能營養(yǎng)素的作用效應(yīng)。
　　 ⑶丙酮酸、丙酮酸肌酸和肌酸對(duì)肉雞肝臟線粒體蛋白/酶表達(dá)譜的影響。本試驗(yàn)選取雄性AA肉雞為研究對(duì)象，研究丙酮酸(Pyr)、丙酮酸肌酸(CrPyr)和肌酸(Cr)對(duì)內(nèi)雞肝臟線粒體脂肪代謝相關(guān)蛋白/酶表達(dá)譜的影響，擬從蛋白水平探討Pyr，CrPyr和Cr調(diào)節(jié)肉雞脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝的機(jī)理。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同第二

9、章。試驗(yàn)方法采用多步差速離心和密度梯度離心聯(lián)合法分離純化肝臟線粒體。采用測(cè)定溶酶體標(biāo)志酶(半乳糖苷酶)，質(zhì)膜標(biāo)志酶(堿性磷酸二酯酶)，線粒體標(biāo)志酶(細(xì)胞色素C氧化酶)和胞漿標(biāo)志酶(乳酸脫氫酶)的活性對(duì)線粒體純度評(píng)價(jià)；以琥珀酸脫氫酶活性估算線粒體的富集度；以及用專一的熒光探針(MitoTracker RED)觀察線粒體形態(tài)。結(jié)果表明，利用差速離心和等密度梯度離心的聯(lián)合可以有效地分離純化線粒體。通過2D-PAGE分離后，經(jīng)圖譜分析獲得差異蛋

10、白點(diǎn)，再進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定。與對(duì)照組相比，CrPyr處理組得到13個(gè)差異蛋白，Pyr處理組得到17個(gè)差異蛋白，Cr處理組得到11個(gè)差異蛋白。試驗(yàn)結(jié)果表明，CrPyr通過下調(diào)脂肪分化相關(guān)蛋白(ADRP)的表達(dá)減少脂肪酸的聚積，抑制ATP合酶的表達(dá)從而減少脂肪細(xì)胞的生成，同時(shí)通過下調(diào)膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)的表達(dá)提高HDL水平和降低TG水平，減少脂肪和膽固醇的沉積；CrPyr和Cr上調(diào)蛋白質(zhì)合成過程中起關(guān)鍵作用的翻譯起

11、始因子2B(eIF2B)因子的蛋白水平，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，且CrPyr作用效果強(qiáng)于Cr；Pyr和Cr上調(diào)脂酰CoA合成酶(ACS)的蛋白表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸的β-氧化分解，減少脂肪沉積；Pyr上調(diào)參與蛋白質(zhì)終止后加工、轉(zhuǎn)運(yùn)的甲硫氨酸胺基肽酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)移酶和熱休克蛋白60的表達(dá)。與Pyr和Cr比較，CrPyr在脂肪分解和蛋白質(zhì)合成上發(fā)揮了更為重要的作用，且作用效果均強(qiáng)于Pyr和Cr。
　　 ⑷丙酮酸、丙酮酸肌酸和肌酸對(duì)肉雞肝臟胞漿蛋白

12、/酶表達(dá)譜的影響。本試驗(yàn)選取雄性AA肉雞為研究對(duì)象，探討丙酮酸(Pyr)、丙酮酸肌酸(CrPyr)和肌酸(Cr)對(duì)肉雞肝臟胞漿蛋白/酶表達(dá)的影響，擬從蛋白水平探討Pyr，CrPyr和Cr調(diào)節(jié)肉雞脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝的機(jī)理。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同第二章。試驗(yàn)方法采用差速離心法分離肝臟胞漿蛋白。通過2D-PAGE分離后，經(jīng)圖譜分析獲得差異蛋白點(diǎn)，再進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定。與對(duì)照組相比，CrPyr處理組得到16個(gè)差異蛋白，Pyr處理組得到1

13、9個(gè)差異蛋白，Cr處理組得到12個(gè)差異蛋白。試驗(yàn)結(jié)果表明，CrPyr和Pyr通過上調(diào)肉雞肝臟胞漿中脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)、下調(diào)膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)的表達(dá)，加快脂肪酸的氧化分解和TG的分解，減少脂肪的沉積，且CrPyr作用效果比Pyr顯著；CrPyr和Cr通過上調(diào)載脂蛋白A-Ⅳ(ApoA-Ⅳ)的表達(dá)，加快TG的分解，減少脂肪的堆積，且CrPyr作用效果比Cr顯著；CyPry還通過上調(diào)肉雞肝臟胞漿中鈣網(wǎng)織蛋白(CRT)和真核翻譯

14、起始因子3a(eIF3a)的水平，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，而Pyr和Cr對(duì)內(nèi)雞肝臟的蛋白質(zhì)代謝沒有明顯的影響。因此，同Pyr和Cr相比較，CrPyr在肉雞肝臟脂肪代謝和蛋白質(zhì)代謝方面發(fā)揮了更積極有效的作用。
　　 ⑸丙酮酸、丙酮酸肌酸和肌酸對(duì)肉雞肌肉蛋白/酶表達(dá)譜的影響。本試驗(yàn)選取雄性AA肉雞為研究對(duì)象，探討丙酮酸(Pyr)、丙酮酸肌酸(CrPyr)和肌酸(Cr)對(duì)內(nèi)雞肌肉蛋白/酶表達(dá)譜的影響，擬從蛋白質(zhì)水平探討Pyr，CrPyr和C

15、r調(diào)節(jié)肉雞肌肉蛋白質(zhì)代謝的機(jī)理。試驗(yàn)設(shè)計(jì)同第二章。試驗(yàn)方法采用組織勻漿法分離肌肉蛋白。通過2D-PAGE分離后，經(jīng)圖譜分析獲得差異蛋白點(diǎn)，再進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定。與對(duì)照組相比，CrPyr處理組鑒定出11個(gè)差異蛋白，Pyr處理組鑒定出11個(gè)差異蛋白，Cr處理組鑒定出得到10個(gè)差異蛋白。試驗(yàn)結(jié)果表明，CrPyr通過增加肌肉中肌酸激酶(MCK)的活性，升高磷酸肌酸的含量；同時(shí)降低磷酸化酶b激酶的活性，減少糖元的分解，使肌肉能量

16、儲(chǔ)備增強(qiáng)，進(jìn)而影響機(jī)體的能量代謝。CrPyr上調(diào)真核翻譯起始因子2(eIF2)的表達(dá)水平，提示其可以促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)的合成，最終表現(xiàn)為肌肉組織中肌球蛋白輕鏈和肌動(dòng)蛋白的表達(dá)的增加。Pyr上調(diào)糖酵解過程中的關(guān)鍵酶丙酮酸激酶(PK)和烯醇化酶的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)參與肌細(xì)胞內(nèi)參與氧運(yùn)輸和貯存的肌紅蛋白的表達(dá)，提示Pyr可以加快缺氧條件下的糖元酵解，對(duì)機(jī)體能量的恢復(fù)有一定的幫助，而對(duì)肌肉的蛋白質(zhì)代謝沒有影響。Cr對(duì)肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的表達(dá)有所影響，同