丙戊酸鈉抑制Aβ老年斑形成和tau蛋白磷酸化的分子生物學(xué)機(jī)制.pdf

1、前言：阿爾茨海默病(Alzhcimer's disease,AD)是一種以進(jìn)行性癡呆為主要特征的神經(jīng)退行性疾病,其主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶力減退、認(rèn)知功能下降和嚴(yán)重的精神障礙。老年斑(senile plaque,SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)和神經(jīng)元缺失為其主要病理特征。
　　 SP主要出現(xiàn)在大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)域,其核心成分是一種由39～43個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小神經(jīng)肽Aβ(amy

2、loid beta peptide,Aβ),Aβ由淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursor protein,APP)等經(jīng)過β-分泌酶及γ-分泌酶水解產(chǎn)生并分泌至細(xì)胞外。在正常生理狀態(tài)下,人腦內(nèi)存在極少量(納摩爾級(jí)濃度)的可溶性Aβ,對神經(jīng)元具有神經(jīng)營養(yǎng)作用。但在AD時(shí),APP經(jīng)過異常剪切加工形成大量Aβ,且Aβ從可溶狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗軤顟B(tài),最終在腦部形成淀粉樣沉積,是AD發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　 Tau蛋白是一種微管相關(guān)

3、蛋白,能與成熟神經(jīng)元的微管結(jié)合,起到促進(jìn)微管形成和穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)的作用。Tau蛋白磷酸化對其與微管的結(jié)合至關(guān)重要。然而,異常的tau蛋白聚合成雙股螺旋絲(paried helical filaments,PHFs),不利于其與微管結(jié)合,并導(dǎo)致微管網(wǎng)絡(luò)不穩(wěn)定和神經(jīng)元死亡。NFTs的形成與tau蛋白過度磷酸化密切相關(guān),且NFTs的數(shù)量與患者的癡呆程度呈正相關(guān)。蛋白激酶(如GSK3、CDK5和MAPK)在tau蛋白磷酸化過程中起重要作用。

4、>　　 丙戊酸鈉(valproate,VPA)是一種廣泛用于治療癲癇和情感障礙的抗驚厥藥物和情緒穩(wěn)定劑。最近的研究顯示,VPA也是一種預(yù)防和治療AD的潛在藥物。VPA通過抑制GSK3β介導(dǎo)的APP的γ-位點(diǎn)剪切減少了AD轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ產(chǎn)生和SP的形成,改善學(xué)習(xí)記憶損傷。但是,VPA是否影響tau蛋白磷酸化及其潛在的機(jī)制尚不清楚。
　　 本研究首先給予APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠VPA治療后,檢測SP形成、Aβ分泌情況、APP的代謝

5、和對tau蛋白磷酸化過程的作用途徑及作用效果,進(jìn)而探討VPA對AD小鼠腦組織SP和NlFTs形成的影響,為探討AD的發(fā)病機(jī)制、尋找治療AD的有效藥物提供理論依據(jù)。此外,本研究通過檢測VPA對岡田酸(okadaic acid,OA)刺激引起的SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白磷酸化的影響及相關(guān)蛋白激酶的變化,進(jìn)一步在細(xì)胞水平探討VPA在AD中的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)材料和方法APP/PS1(APPswe/PSEN1dE9)轉(zhuǎn)

6、基因小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室,通過常規(guī)喂養(yǎng)(22-25℃,50％濕度,12h光照循環(huán)),繁殖后經(jīng)PCR進(jìn)行基因型鑒定,鑒定后的小鼠用于實(shí)驗(yàn)。將20周齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為對照組和VPA治療組。VPA治療組小鼠腹腔注射VPA(50mg/kg),每日1次,對照組小鼠給予等量的生理鹽水。12周后,小鼠經(jīng)麻醉處死取材,腦組織兩側(cè)半球分開,右側(cè)腦組織于4％多聚甲醛中固定后石蠟包埋,用于免疫組化分析,左側(cè)腦組織-80℃低溫冷凍

7、保存,用于生化檢測、免疫印跡、ELISA分析等。
　　 對OA處理的SH-SY5Y細(xì)胞,給予VPA作用24h,然后應(yīng)用免疫熒光和免疫印跡等方法檢測tau蛋白磷酸化及其相關(guān)信號(hào)通路蛋白的變化。
　　 結(jié)果：
　　 一、VPA對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ老年斑形成的影響
　　 1、VPA減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ沉積和SP形成應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察各組小鼠腦內(nèi)SP的數(shù)量及大小,結(jié)果表明VPA治療

8、組小鼠的大腦皮層及海馬等區(qū)域出現(xiàn)的陽性SP數(shù)目與對照組相比分別顯著減少60％,斑塊沉積也分別由0.55％降到0.26％、0.50％降到0.19％,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。ELISA結(jié)果顯示,VPA治療組小鼠腦內(nèi)可溶性Aβ的水平由89pg/mg降到77pg/mg,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、VPA對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP裂解酶蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果分析表明,與對照組相比,VPA治療

9、組APP695在蛋白水平?jīng)]有明顯變化(P＞0.05)。然后我們檢測了APP裂解酶的蛋白變化,統(tǒng)計(jì)分析表明,與對照組相比,VPA治療組轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP裂解酶BACE1表達(dá)明顯減少11％(P＜0.05),而ADAM10和PS1的蛋白表達(dá)兩組比較沒有明顯差異(P＞0.05)。
　　 二、VPA對tau蛋白磷酸化的影響
　　 (一)VPA對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化的影響
　　 1、VPA抑制APP

10、/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化應(yīng)用Western blot檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)tau蛋白的幾個(gè)重要磷酸化位點(diǎn)(Thr205、Thr231和Ser396)的磷酸化水平,結(jié)果顯示:在兩組實(shí)驗(yàn)小鼠腦內(nèi)總tau蛋白表達(dá)無顯著差異的情況下,VPA治療組小鼠腦內(nèi)tau蛋白的磷酸化程度明顯低于對照組,降低幅度分別為65％(Thr205,P＜0.01),57％(Ser396,P＜0.01)和54％(Thr231,P＜0.05)。提示

11、VPA抑制了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)tau蛋白的磷酸化。
　　 2、VPA抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)CDK5和GSK3β的活性用Western blot檢測CDK5和GSK3磷酸化水平。與對照組相比,VPA沒有明顯影響APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)CDK5的蛋白水平,但顯著降低了p-CDK5(Tyr15)的水平。定量分析表明VPA治療組小鼠腦內(nèi)的p-CDK5/CDK5比值較對照組降低了34％(P＜0.05)。此外,VPA

12、治療組轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)p-GSK3β(Ser9)的表達(dá)水平明顯升高且p-GSK3β/GSK3β比值增加了39％(P＜0.05)。但是,p-GSK3α/GSK3α比值未見明顯的變化(P＞0.05)。這些數(shù)據(jù)表明,VPA治療明顯抑制了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)CDK5和GSK313的活性。
　　 3、VPA對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)p35/25蛋白表達(dá)的影響由于CDK5的激活需要p35的存在,p35裂解為p25可以持續(xù)激活CDK

13、5,因此,我們進(jìn)一步采用Western blot檢測了p35/25的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示p35的蛋白表達(dá)沒有明顯變化(P＞0.05),但未檢測到p25的蛋白表達(dá)。
　　 (二)VPA對OA處理的SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白磷酸化的影響
　　 1、VPA抑制OA處理的SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白磷酸化為了進(jìn)一步在體外探討VPA對tau蛋白磷酸化的影響,我們用OA處理SH-SY5Y細(xì)胞以誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化,然后給予VPA作用

14、24h,觀察VPA對培養(yǎng)細(xì)胞的tau蛋白磷酸化水平的影響。定量分析表明,與對照組相比,VPA處理組與對照組細(xì)胞總tau蛋白的含量沒有明顯變化,而VPA處理組細(xì)胞的tau磷酸化水平分別降低40％(Thr205,P＜0.05),27％(Ser396,P＜0.01)和16％(Thr231,P＜0.05)。此外,免疫熒光染色激光共聚焦掃描顯微鏡分析顯示,VPA處理降低了磷酸化tau蛋白Thr231的熒光強(qiáng)度。上述結(jié)果表明,VPA能抑制OA處理的

15、SH-SY5Y細(xì)胞tau蛋白過度磷酸化。
　　 2、VPA抑制OA處理的SH-SY5Y細(xì)胞CDK5和GSK313的活性激光共聚焦掃描顯微鏡分析結(jié)果顯示,p-CDK5免疫熒光強(qiáng)度在VPA處理的細(xì)胞中明顯降低。Western blot結(jié)果表明,與對照組相比,VPA處理組p-CDK5/CDK5的比值顯著降低了38％。此外,與OA處理的對照組細(xì)胞相比,VPA處理組細(xì)胞p-GSK3β/GSK3β的比值顯著增加了48％。
　　 CD

16、K5的磷酸化水平與其活性成正相關(guān),而GSK3β的磷酸化水平與其活性成負(fù)相關(guān)。因此,以上數(shù)據(jù)表明,VPA能抑制OA處理的SH-SY5Y細(xì)胞CDK5和GSK3β的活性。
　　 3、VPA對OA處理的SH-SY5Y細(xì)胞p35/25蛋白表達(dá)的影響激光共聚焦掃描顯微鏡分析結(jié)果表明,VPA減少了p35/25免疫熒光強(qiáng)度(抗體可以識(shí)別p35和p25),且同時(shí)伴有磷酸化tau蛋白(Thr231)免疫熒光強(qiáng)度的減弱。Western blot結(jié)果顯

17、示,VPA處理并未改變OA處理的細(xì)胞中p35蛋白的表達(dá)水平,而p25/p35的比值顯著下降,與對照組相比,VPA處理使p25/p35的比值下降了28％(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、VPA處理可以減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)SP的形成和β-分泌酶的蛋白表達(dá)水平,抑制APP的淀粉樣蛋白途徑；
　　 2、VPA處理可以抑制APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)及OA處理的SH-SY5Y細(xì)胞的tau蛋白磷酸化；<