牙周病分子生物學(xué)

1、牙周病分子生物學(xué)Molecular Biology of Periodontal Diseases,李 德 懿上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院,一、概述二、牙周病的分子致病　　1.微生物的毒力因子　　2.宿主因子三、核酸雜交法檢測牙周病有關(guān)細(xì)菌,定義（Definition） 分子生物學(xué)技術(shù)研究與牙周病密切相關(guān)生物大分子（蛋白、核酸）的一門新興學(xué)科──前瞻性、交叉性。,研究內(nèi)容宿主基因水平或分子水平闡明牙周病發(fā)病

2、機制和流行規(guī)律牙周病原菌的蛋白和核酸(DNA、RNA)分子結(jié)構(gòu)──追蹤病原菌傳播途徑、發(fā)現(xiàn)病原體變異。牙周病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律與微觀的病原菌或宿主基因特征聯(lián)系起來──牙周病臨床的分子診斷、分子指征、分子預(yù)后乃至基因治療,牙周病的分子致病Molecular Pathogenesis of Periodontal Disease,微生物的毒力因子 研究牙周病原菌的蛋白和核酸分子結(jié)構(gòu)，評價毒力因子的作用。宿主因子

3、 研究細(xì)胞因子和遺傳因子的作用。,微生物的毒力因子Microbial Viralence Factors,內(nèi)毒素(lipopolysaccharide, LPS) G-菌胞壁外膜的脂多糖成分（磷脂－多糖－蛋白質(zhì)）。,十二烷基磺酸鈉－聚丙烯凝膠電泳 PAGE-SDS gel銀染色Silver stain內(nèi)毒素－免疫印跡LPS-immuno-blotting,牙齦素(gingipains)最初稱為

4、胰酶樣蛋白酶(trypsin-like protease, TLP),又稱卟啉素(porphypains)存在于Pg的外膜、膜泡或胞外的一組蛋白酶超速離心(10000g×20min,4℃)提取胞外膜泡——高凝膠液相色譜法(GF-HPLC)分離純化。,精氨酸－牙齦素(Arginine-gingipains, Rgps):特異性切斷蛋白質(zhì)與精氨酸殘基結(jié)合的肽段，由rgpA(前肽區(qū)、蛋白酶區(qū)、粘附區(qū))和rgpB(無粘附區(qū))二個

5、基因編碼賴氨酸－牙齦素(Lysine-gingipain, Kgp):特異性切斷蛋白質(zhì)與賴氨酸殘基結(jié)合的肽段，由kgp(前肽區(qū)、蛋白酶區(qū)、粘附區(qū))單個基因編碼,Pg同源突變株的性狀改變 突變株性狀改變rgpA粘附能力部分喪失降解I型膠原能力喪失rgpA、rgpB抑制中性粒細(xì)胞功能喪失菌毛缺失kgp菌落無法變黑(影響利用血紅蛋白)rgpA、rgpB、kgp胞外蛋白水解活性喪失,,,,牙齦素功能

6、有助于粘附定植：對纖維蛋白的親和力。毒性作用：破壞宿主組織細(xì)胞的活性成分(蛋白、多肽)、降解膠原；促進緩激肽釋放，提高血管通滲性，增加齦溝液量，組織水腫。幫助細(xì)胞生長：將組織蛋白質(zhì)降解為短肽鏈，擴大細(xì)菌營養(yǎng)攝取范圍，為細(xì)菌生長和毒力發(fā)揮提供養(yǎng)分。干擾宿主免疫反應(yīng)：影響中性白細(xì)胞功能，降解宿主細(xì)胞的LPS受體CD14，降解細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNFα等。,菌毛亞單位蛋白結(jié)構(gòu)基因(fim A) 粘附有

7、關(guān)的毒力因子── 纖毛素(fimbrilin) 粘附素(adhesin) 血細(xì)胞凝集素(hemagglutinin),1988年Dickinson等首先獲得含編碼Pg纖毛素基因的克隆質(zhì)粒PUC

8、13Bg12.1，該基因為染色體上的單拷貝基因，它的氨基酸序列與其他菌毛無同源性，可利用該特異基因作探針鑒定Pg，可進一步研究Pg菌毛的致病作用。,膠原酶基因(prtc) Pg的膠原酶能降解I型膠原，破壞牙周組織附著。 已測知表達膠原酶活性的prtc基因序列，它存在于Pg的三種主要血清型中，編碼1個37501.38μ蛋白質(zhì)。,白細(xì)胞毒素基因(lkt A、B、C、D) Aa是口腔中唯一能

9、產(chǎn)生白細(xì)胞毒素(leukotoxin,LKT)的細(xì)菌，白細(xì)胞毒素僅能殺死人或靈長類的多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，抑制破壞宿主的免疫防御機制。 現(xiàn)已克隆和測知lkt A的序列，且在受體菌中得到表達。編碼毒素結(jié)構(gòu)，激活白細(xì)胞毒素。,宿主因子Host Factors,細(xì)胞因子(cytokines) 細(xì)胞生物學(xué) 細(xì)胞因子cytokine(CK)免疫學(xué)淋巴因子lymphokine interleukin

10、cytikine(LI)血液學(xué)集落刺激因子colony stimulation factor(CSF)分子生物學(xué)生長因子growth factors(GFS),活化的免疫細(xì)胞和某些基質(zhì)細(xì)胞分泌的微量生物活性物質(zhì)。本質(zhì)是蛋白質(zhì)或多肽。在體內(nèi)發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用，與生長、分化、免疫、腫瘤、造血和創(chuàng)傷愈合等多種生理、病理狀態(tài)有關(guān)。正常情況下發(fā)揮廣泛生理功能，一旦失調(diào)異常分泌，又與疾病相關(guān)。,目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子有10余族

11、，每族又有若干亞族，共100多種，功能大多已闡明，部分已克隆成功，其基因定位、結(jié)構(gòu)與受體結(jié)合機制等均有大量研究。,白介素(1-18型糖蛋白)(interleukin, IL)腫瘤壞死因子(tumor nocrosis factor, TNF)粘附分子(adhesion molecule, AM)干擾素(interferan, IFN)轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor- β, TGF- β)

12、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factors, FGFs),細(xì)胞因子作用特點特異性(自分泌、旁分泌作用)對靶細(xì)胞存在不同程度特異性。多樣性、多功能性對不同靶細(xì)胞、不同濃度或不同生理狀態(tài)靶細(xì)胞可有不同作用。整體性對細(xì)胞、組織的調(diào)控不是僅靠1種，而是多因子參與及多步驟反應(yīng)，由幾種因子協(xié)同或拮抗配合形成網(wǎng)絡(luò)(network)發(fā)揮作用。,遺傳因子(genetic factors) 基因水平

13、闡明牙周病發(fā)生、發(fā)展和流行規(guī)律。,細(xì)菌是引發(fā)牙周炎必不可少的因素，但不是唯一因素，宿主也起重要作用。 單純遺傳能為患嚴(yán)重牙周炎提供50%以上危險性，如： 白細(xì)胞減少癥 白細(xì)胞粘附缺陷病 Down綜合征 掌跖角化－牙周破壞綜合征,牙周病的基因研究6號染色體組織相容性位點變異產(chǎn)生IgG2能力降低， IgG2是保護性的，能調(diào)理識別細(xì)菌，以利吞噬殺死。染色體1

14、q H131殘基多態(tài)性組氨酸純合子 吞噬細(xì)胞識別IgG2的hFcrRⅡa 受體親和力高(IgG包裹的致病 菌易被吞噬清除)精氨酸純合子 受體親和力低組/精氨酸雜合子 親和力居中,染色體2q 13的IL-1β基因多態(tài)性產(chǎn)生的IL-1β約為該基因陰性的

15、4倍，40歲后患重度牙周炎的可能性是陰性個體的20倍6號染色體TNF-α基因多態(tài)性產(chǎn)生大量TNF-α，增強對感染的反應(yīng)性,核酸雜交法(molecular hybridization)檢測牙周病相關(guān)細(xì)菌,概 述,細(xì)菌分類學(xué)四個水平細(xì)菌形態(tài)和行為水平：顯微結(jié)構(gòu)、運動性、酶、生化及營養(yǎng)需要等細(xì)菌組分水平：胞壁組分、脂類、細(xì)胞色素及噬菌體系分析蛋白質(zhì)水平：氨基酸系列、可溶性蛋白凝膠電泳及血清學(xué)基因水平：G＋C mol%，D

16、NA-DNA雜交，質(zhì)粒及遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo),牙周病有關(guān)的特殊細(xì)菌證據(jù)充分的致病菌中等證據(jù)的致病菌伴放線放線桿菌Aa直腸彎曲菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)(campylobacter rectus)牙齦卟啉單胞菌Pg纏結(jié)優(yōu)桿菌(Porphyromonas gingivalis)(Eubacterium nodatum)福塞似桿菌Bf具核梭桿菌Fn (Bact

17、eroides forsythus)(Fusobacteruim nucleatum)中間普氏菌Pi(prevotella intermedia)微小消化鏈球菌Pm (Peptostreptocoscus micros)中間鏈球菌群(Intermedius streptococci)牙密螺旋體Td(Treponema denticola),,,,常規(guī)方法不能鑒定牙周大量標(biāo)

18、本細(xì)菌的原因：大多為厭氧菌培養(yǎng)條件要求高鑒定繁雜每牙周袋至少取2個區(qū)樣本每樣本至少分離10株以上可疑菌,原理 所有生物體都以DNA形式通過4種堿基順序來貯存遺傳信息，同種生物含相同的DNA序列，生物種差別越大，DNA堿基順序差別越大。 鳥嘌呤 腺嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶G ＋ A ＝ C ＋ T

19、 C T 示蹤劑標(biāo)記的特定堿基序列的核酸片段，能和互補堿基配對、特異地結(jié)合。,,,4種核苷酸組成DNA2條互補鏈繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)(氫鍵)－嚴(yán)格配對規(guī)律牢固結(jié)合，使DNA具遺傳信息貯存庫功能（恒定性、專一性）DNA上相鄰3個核苷酸編排1個密碼子，決定1個特定氨基酸DNA核苷酸順序決定蛋白質(zhì)的氨基酸順序－決定細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能,核酸探針(probe)定義 能與特定核

20、酸序列發(fā)生特異性互補的已知核酸片段，用于檢測待測樣品中是否存在與探針相同或相近的DNA序列。,牙周病相關(guān)菌的核酸探針是牙周病相關(guān)菌染色體DNA上的有種屬特異性的一小段DNA（或RNA）分子的堿基序列，為帶標(biāo)記的單股核苷酸，能以互補方式與相應(yīng)DNA鍵結(jié)合。用已知細(xì)菌的DNA探針去探測未知細(xì)菌的DNA，若能雜交形成DNA雙鏈則認(rèn)為該菌為與探針相同的菌。,放射性同位素標(biāo)記：如 32P、35S、3H靈敏度高理化影響小污染環(huán)境

21、使用某些半抗原：如 生物素、地高辛、熒光素特異性較低敏感性較低,合成小段單鏈DNA方法日臻完善寡核苷酸的化學(xué)合成可由高度自動化的儀器完成核酸雜交技術(shù)得到發(fā)展,探針類型全基因探針：屬內(nèi)代表菌株分離出DNA并進行標(biāo)記，制備簡便，特異性較差，有時可與相近屬菌種發(fā)生雜交克隆DNA片段探針隨意探針：代表菌DNA用限制性內(nèi)切酶酶切，隨意克隆一些片段，找到僅能與本屬內(nèi)菌株雜交的DNA片段特異性高，但需大量試驗方能驗證其特異性特定

22、探針：克隆屬內(nèi)代表菌特異性蛋白或毒力因子的基因，從該基因中取一段作為探針，檢驗致病菌具獨特作用，但需對其特異性、敏感性驗證,探針的驗證特異性驗證：必須與50種菌屬的80~300株菌株進行雜交必須與相近細(xì)菌屬中的大量菌間排除“交叉雜交”如伴放線放線桿菌－嗜血桿菌屬菌株敏感性驗證：必須與同屬各地區(qū)分離的100株以上菌種進行雜交如核酸雜交結(jié)果與生化反應(yīng)鑒定結(jié)果有出入，應(yīng)進一步驗證生化結(jié)果。,寡核苷酸(oligonucleotid

23、e)探針序列細(xì)菌 探針名稱 序列AaAa-2CTTCGGGCACYAGGGCTAAACCCCPgPg-1CAATACTCGTATCGCCCGTTATTCPg-3CTGTGGAATCTTGACGGTATATCGPg-4GTATAAAAGAAGTTTAAAYCCTTPg-5CCGATGCTTATTCTTACGGTACATPg-6CCTTAGGACAG

24、TCTTCCTTCACGCBfBf-2CGTATCTCATTTTATTCCCCTGTABf-4CTGTAGAGCTTACACTATATCGCAPiPi-1GGTCCTTATTCGAAGGGTAAATGCPi-2CCCTAGGYGCGCTCCTCGCGGTTA,,,,特定DNA片段探針序列（基因探針）細(xì)菌 靶基因 序列 長度AaLkta5’-CAGCAAG

25、CTGCACAGTTTGCAAA-3’238bp5’-CATTAGTTAATGCCGGGCCGTCT-3’16Sr DNA5’-GCTAATACCGCGTAGAGTCGG-3’443bp5’-ATTTCACCCTCACTTAAAGGT-3’ 16Sr DNA 5’-CTCAGAGATGGTTTGTGCC-3’273bp5’-AGATTCACTCCCCATCGCTG-3’Pg

26、 Fim A5’-ATAATGGAGAACAGCAGGAA-3’131bp5’-TCTTGCCAACCAGTTCCATTGC-3’Prt C5’-ACAATCCACGAGACCATC-3’584bp5’-TTCAGCCACACCGAGACG-3’16Sr DNA5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’404bp5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’,,,,續(xù)表

27、細(xì)菌 靶基因 序列 長度Pg16Sr RNA5’-GCGTATGCAACTTGCCTTAC-3’518bp5’-GTTTCAACGGCAGGCTGAAC-3’Fn50475’-CAAATGCTTGTGTCAATAATACT-3’0.5Kb5’-TTTAGAAGAAATGGTAGAATAAT-3’505905’-ATTGTGGCTAAAATTASTAGTT

28、-3’1Kb5’-ACCCTCACTTTGAGGATTATAG-3’Pi 18Sr RNA5’-CCTAATACCCGATGTCCACA-3’855bp5’-AAGGAGTCAACATCTCTGTATCC-3’TdTdpA5’-AAGGCGGTAGAGCCGCTCA-3’311bp5’-AGCCGCTGTCGAAAAGCCA-3’,,,,PCR擴增16SrRNA 基因－病原菌檢測遺傳

29、學(xué)分類 rRNA是細(xì)胞中最多的一種RHA，很多分子組成核蛋白體(核糖體)，rRNA分子大小一般用超速離心的沉降系數(shù)S表示，S越大，分子也越大。,16SrRNA基因：細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列保守區(qū)－穩(wěn)定性（細(xì)菌共有，稱“分子化石”）可變區(qū)－特異性（保守區(qū)間有V1－V10可變區(qū)，含種屬差異信息，如出現(xiàn)3個堿基以上差異，便可判定不同屬）多拷貝－敏感性（約1500個核苷酸，每細(xì)菌含5－10個拷貝）,16S

30、rRNA編碼基因保守區(qū)的引物：對所有細(xì)菌均適宜的引物可變區(qū)的引物：PCR擴增，凝膠電泳可鑒別細(xì)菌種屬間隔區(qū)的引物：16SrRNA和23SrRNA編碼基因間存在0.5Kb間隔區(qū)，不同種屬間隔區(qū)長度的序列有特異性，可鑒別細(xì)菌種屬,優(yōu)點靈敏度高、特異性強、提高檢測質(zhì)量不依賴培養(yǎng)，可直接從標(biāo)本檢測可鑒別營養(yǎng)要求復(fù)雜，生長緩慢微生物，特別目前不能體外培養(yǎng)繁殖的細(xì)菌能克服表型變異影響：形態(tài)變化、死菌、混雜菌能鑒定菌種、毒種及亞種（提

31、供不同病原體DNA分子“指紋”圖，未解釋病因?qū)W、流行病學(xué)可檢測細(xì)菌對抗生素的耐藥現(xiàn)象,缺點技術(shù)過于苛求，需一定條件和設(shè)備 大部分探針需進口，化費較大,應(yīng)用牙周細(xì)菌分類、分型、快速檢測評估細(xì)菌毒力因子作用檢測細(xì)菌基因異常及異常表達臨床檢測、流行規(guī)律,小 結(jié) 牙周病分子生物學(xué)是研究牙周病原體的蛋白和核酸(DNA, RNA)分子結(jié)構(gòu)，用分子生物學(xué)方法追蹤病原體傳播途徑，發(fā)現(xiàn)病原體變異；從宿主基因水平或分子水平闡明牙周病的