分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)

1、分子生物學(xué),教師： 樊寶良,聯(lián)系方式：E-mail:fanbl119@vip.sina.com電話：7528476,主要學(xué)習(xí)內(nèi)容,緒論DNA的結(jié)構(gòu)DNA的生物合成RNA的生物合成蛋白質(zhì)的生物合成原核生物的基因表達(dá)調(diào)控真核生物的基因表達(dá)調(diào)控,Benjamin Lewin. Genes VI, Oxford Uni. Press, 1997 Weaver R. Molecular Biology. 科學(xué)出版社 2001 T

2、urner P.C. et al. Molecular Biology. 科學(xué)出版社 2001閻隆飛 張玉麟。 《分子生物學(xué)》，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1997朱玉賢 李毅?！冬F(xiàn)代分子生物學(xué)》，高等教育出版社，1997李振剛。《分子遺傳學(xué)》，科學(xué)出版社，2000,,主要參考書目和重要網(wǎng)址,參考教材,英文原版,中文譯本,Lodish/berk et al.,STRYER et al Version 5,中國(guó)生物信息： http:/

3、/www.biosino.org/分子生物學(xué)信息網(wǎng) ：http://www.37c.com.cn生命科學(xué)商務(wù)網(wǎng)： http://www.e800b2b.com 生物軟件網(wǎng) http://www.bio-soft.net/ www.google.com中華基因網(wǎng)：http://www.chinagenenet.com/Celera Genomics Education (賽萊拉）: http://

4、www.celera.com/genomics/geneed/c/c/geneed/geneed.cfmBiology Animation Library （冷泉港）: http://vector.cshl.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htmhttp:/vector.cshl.org/dnaftb/Jeffrey Qinxi Shen’s Page （沈慶喜教授）: http://w

5、ww.unlv.edu/faculty/geffshen/Beginner’s Guide to Molecular Biology: http://www.iacr.bbsrc.ac.uk/notebook/courses/guide/Ergito (Genes VII 電子版）: http://www.genes.netTutorials in Molecular Biology: http://www.locutus.lsi

6、c.ucla.edu/ls3/tutorials/Graphics Gallery from gene to function: http://www.accessexcellence.org/AB/GC,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)參考書目,1 . 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南2. 精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南3. PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南4. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)5. 現(xiàn)代分生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)7. 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)8. 分子生物學(xué)基礎(chǔ)技術(shù),第一章

7、 緒 論,一、分子生物學(xué)的基本含義二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容三、分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史四、分子生物學(xué)與其他學(xué)科的關(guān)系,,,3、主要任務(wù) 闡明生物大分子的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,2、研究對(duì)象 核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳 信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用,1、定義 從分子水平研究生命本質(zhì)的一門新興邊緣學(xué)科,一、分子生物學(xué)的基本含義,,二、分子生物學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容,核酸的分子生物學(xué) 分離克隆

8、基因 （clone） 確定基因的結(jié)構(gòu) (structure) 基因的功能研究 (function) 生化功能 生理功能 基因表達(dá)調(diào)控研究 (express control)蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué),三、分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史,1.準(zhǔn)備和醞釀階段(1865-1953) 蛋白質(zhì) DNA 2.初步建立和發(fā)展階段(1953

9、-1970) 中心法則 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能3.深入發(fā)展階段(1970-今） 重組DNA技術(shù) 基因組研究 基因表達(dá)調(diào)控 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),1.準(zhǔn)備和醞釀階段,(1822 - 1884),分離定律自由組合定律遺傳因子學(xué)說,,,,,孟德爾分離律圖示,,布爾諾（Brno）自然科學(xué)學(xué)會(huì),德弗里斯 荷蘭,柯靈斯 德國(guó),契馬克澳大利亞,“重新發(fā)現(xiàn)”孟德爾遺傳定律,Friedrich Miesc

10、her (1844-1895),1869年法國(guó)的米歇爾從白細(xì)胞核中分離出DNA1879年德國(guó)生物學(xué)家弗萊明發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)的染色體1903年美國(guó)細(xì)胞學(xué)家薩頓提出了遺傳的染色體學(xué)說 1909年丹麥生物學(xué)家約翰遜創(chuàng)造了基因（gene）一詞,Wilhelm Ludwig Johannsen 1857～1927,Thomas Hunt Morgan 1866～1945191

11、0年創(chuàng)立遺傳的染色體理論,2,1913年A.H.Stutervant提出以交換值作為染色體上基因相對(duì)距離的想法,1927年 美國(guó)遺傳學(xué)家繆勒發(fā)現(xiàn)X射線照射可人工誘使遺傳基因發(fā)生突變,1931Barbara McClintock和 Harriet Creighton : 轉(zhuǎn)座子假說,1902-1992,1941George Beadle 和E. L. Tatum：一基因一酶學(xué)說,DNA是遺傳物質(zhì)1928年 Frederick G

12、riffith,1944年Avery, MacLeod, and McCarty,噬菌體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),1952年 Alfred Hershey and Martha Chase,2、建立和發(fā)展階段,1953 James Watson and Francis Crick DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立,,1958Matthew Meselson and Franklin Stahl（DNA半保留復(fù)制 ）1961

13、Sidney Brenner, François Jacob & Matthew Meselson1966Marshall Nirenberg & Har Gobind Khorana（遺傳密碼破譯）1970 Hamilton Smith（DNA 限制酶 ）1972Paul Berg （DNA連接）,The central dogma,1970年， Baltimore和 Temin等同時(shí)

14、各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶,定向基因改造設(shè)想,設(shè)想一,能否讓禾本科的植物也能夠固定空氣中的氮？,能否讓細(xì)菌“吐出”蠶絲？,設(shè)想二,能否讓牛產(chǎn)生出人的胰島素、干擾素等珍貴的藥物？,設(shè)想三,經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀(jì)70年代創(chuàng)立了可以定向改造生物的新技術(shù)——基因工程。,3、深入發(fā)展階段,（二）技術(shù)上的四大發(fā)明,基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶,基因的針線——DNA連接酶,基因的車子——載體,逆轉(zhuǎn)錄酶,限制性內(nèi)切酶,能識(shí)別雙鏈DNA中特定堿基順序的核

15、酸水解酶大都從原核生物中發(fā)現(xiàn)提取的以內(nèi)切方式水解核酸鏈中磷酸二酯鍵 5’-P 3’-OH分類： Ⅰ型:復(fù)合功能酶,兼有修飾、切割兩種特性，識(shí)別位點(diǎn) 和切割位點(diǎn)不一致，不能形成特異片段。 Ⅲ型：與Ⅰ型相似。 Ⅱ型：通常所說的限制性內(nèi)切酶，識(shí)別序列為4～6個(gè)bp。,DNA連接酶,將互補(bǔ)配對(duì)的兩個(gè)黏性末端連接起來，使之成為一個(gè)完整的DNA分子。連接的部位：磷酸二酯鍵，不是氫鍵

16、,載體,是攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。質(zhì)粒（plasmid)為最常用的載體。 可自主復(fù)制 有遺傳標(biāo)記和篩選標(biāo)記 具多克隆位點(diǎn),X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷),IPTG （異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）,β-半乳糖苷酶（309個(gè)氨基酸）前146個(gè)氨基酸構(gòu)成一個(gè)短的片段稱為α片段，其余的稱為β片段,逆轉(zhuǎn)錄酶,1970年， Baltimor

17、e和 Temin等同時(shí)各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了遺傳學(xué)的中心法則，使真核基因的制備成為可能,1973年Cohen完成第一個(gè)基因工程實(shí)驗(yàn),經(jīng)體外重組獲得雜合DNA雜合子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌,,所需元件： 限制性內(nèi)切酶 連接酶 載體 受體細(xì)胞,,1977年 Walter Gilbert and Frederick Sanger（DNA測(cè)序技術(shù)）,基因工程過程示意圖,①從細(xì)胞中分離出DN

18、A,,,②限制酶截取DNA片斷,③分離大腸桿菌中的質(zhì)粒,④ DNA重組,⑤用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,⑥培養(yǎng)大腸桿菌克隆大量基因,Two Methods for Delivering DNA into Plant Cells,,,,1994Transgenic tomatoes sold in the shops,制備抗蟲轉(zhuǎn)基因植物。,分離毒素蛋白基因,將毒素基因插入到Ti質(zhì)粒中,Two methods of producing t

19、ransgenic mice,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程。,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般制備過程（續(xù)）。,帶有人生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,正常小鼠,1988Transgenic sheep,α－抗胰蛋白酶,1989a transgenic pig,人生長(zhǎng)激素基因,,,Producing Enviropigs,Transgenic pig,Microinjection of genes into pig egg,,克隆技術(shù),,豬、牛

20、、馬、騾、猴、貓、水牛、大鼠、小鼠,體細(xì)胞克隆技術(shù)的應(yīng)用——轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作,轉(zhuǎn)基因食品 安全性問題及對(duì)策,,,,1942年－1945年,1961年－1969年,1990年－2003年,1969年7月16日發(fā)射成功載人登月的阿波羅11號(hào)飛船,1945年8月6日上午8時(shí)15分17秒美國(guó)向廣島投放了稱為小男孩的原子彈,2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6國(guó)科學(xué)家宣布人類基因組序列圖繪制成功，人

21、類基因組計(jì)劃的所有目標(biāo)全部實(shí)現(xiàn)。,25000,基因組,一個(gè)生物的所有基因一套完整單體的遺傳物質(zhì)總和人類基因組計(jì)劃 Human　Genome　Project,HGP 于1990年正式啟動(dòng) 識(shí)別人類DNA中所有基因 測(cè)定人類DNA的30億堿基對(duì)的序列 將這些信息儲(chǔ)存到數(shù)據(jù)庫中 開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具 解決可能引發(fā)的倫理,法律和社會(huì)問題,物種 DNA數(shù)量

22、HBV 3.2kb噬菌體 49kb大腸桿 4000kb酵母 17000kb果蠅 164000kb人 3000000kb,對(duì)人類而言：22+X+Y+mtDNA,人類基因組,100-200 kb克隆片段,基因組測(cè)序的一般流程,分級(jí)鳥槍測(cè)序法,基因組DNA,細(xì)菌人工染色體文庫,DNA克隆的排序 （物理作圖）,分段測(cè)序,隨機(jī)打斷后克隆,

23、DNA測(cè)序,DNA序列的組裝,2001年為止已經(jīng)測(cè)定了 599種病毒與類病毒 205種自然存在的質(zhì)粒 185種細(xì)胞器 31種真細(xì)菌 7種古細(xì)菌 1種真菌 2種動(dòng)物 1種植物 2001年10月中國(guó)雜交水稻（秈稻）基因組工作框架圖完成2003年4月 人類基因組序列圖繪制成功2003年11月家蠶基因組“框架圖”繪制完成20

24、04年3月完成紅原雞基因組序列圖的測(cè)序和組裝工作2004年10月21日Mimivirus病毒的基因組圖譜繪制2005年 1月木瓜全基因組測(cè)序啟動(dòng)。,截至到2005年有關(guān)分子生物學(xué)諾貝爾獲獎(jiǎng)名單,年份 獲獎(jiǎng)?wù)?內(nèi)容 所獲的諾貝爾獎(jiǎng)1962年 J.D.Wasten， DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

25、 H.C.Click1965年 F.Jacob 基因調(diào)控乳糖操縱子 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) J.L.Monod1966年 F.P.Rous 病毒致癌學(xué)說 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)1968年 R.W.Holley 核糖核酸中心法則 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) H.

26、G.Khorana M.W.Nurenberg1969年 M.Delbruck 噬菌體基因研究 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) A.D.Hershey S.E.Luria1972年 S.Moore 核糖核酸三維結(jié)構(gòu) 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) W.H.Stein1974年 A.Claude

27、 分離細(xì)胞發(fā)現(xiàn)RNA病毒 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) G.E.Palade,1975年 D.Baltimore 逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA病毒 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) H.M.Temin R.Dolbeco1978年 W.Arber DNA限制性內(nèi)切酶 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)

28、 D.Nathens H.O.Smith1980年 P.Berg 重組 DNA 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) W.Gilbert DNA順序分析1982年 A.Klug 核酸蛋白復(fù)合體 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1986年 R.L.Montalcini 生長(zhǎng)因子 諾貝爾

29、生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) S.Cohen1988年 G.Eline 抗DNA合成類藥物 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) G.Hitchigns1989年 J.M.Bishop 癌基因?qū)W說 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) H.E.armans T.CachRNA 酶催化活性

30、 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) S.Altman(Ribozyme),1993年 R.Roberts， 斷裂基因 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) P.sharp K.B.Mullis PCR儀 諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) M.Smith 寡聚核苷酸介導(dǎo)基因突變法 諾貝爾

31、化學(xué)獎(jiǎng)1994年 A.Gliman 信號(hào)傳導(dǎo)和G-蛋白 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) M.Rodbell1995年 E.B.Lewis, C基因和果蠅突變關(guān)系探討 諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) Nusslein-Volhard， E.Wieschaus,（三）分子生物學(xué)的發(fā)展趨勢(shì),進(jìn)一步完善相關(guān)技術(shù) 微量化 自動(dòng)化 產(chǎn)業(yè)

32、化 高通量學(xué)科的交叉、融合,2、細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系 細(xì)胞是生命的基本功能單位，基因功能必須通過細(xì)胞來表現(xiàn)，離開細(xì)胞，就沒有生命。人工生命：美國(guó)洛克菲勒J(rèn). Craig Venter研究所,四、分子生物學(xué)與其他學(xué)科的關(guān)系,1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系,分子生物學(xué)：信息傳遞過程生 物 化 學(xué)：物質(zhì)與能量轉(zhuǎn)換過程生物化學(xué)是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)；分子生物學(xué)≠生物化學(xué),4、遺傳學(xué)與分子生物學(xué)關(guān)系 研