分子生物學常用實驗技術概述

1、常用分子生物學技術,分子雜交技術,利用單鏈核苷酸堿基互補配對；抗原與抗體、受體與配體、蛋白與其他分子的相互作用進行目的核酸、蛋白質(zhì)檢測，廣泛用于基因重組、生物印跡示蹤、生物芯片等領域，具有高特異性、高靈敏度、高通量等特點的技術。,核酸雜交(nucleic acid hybridization),DNA的變性(Denaturation) ：維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵和疏水鍵的斷裂，DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象復性：

2、變性DNA 在適當條件下，二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。核酸分子雜交：指具有一定互補序列不同來源的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補配對原則經(jīng)過退火處理，形成異源雙鏈的過程 。,核酸雜交,核酸雜交探針(probe)：能夠與靶分子核酸按堿基互補原則特異性相互作用的一段已知序列的寡核苷酸或核酸。Southern blot: 通過限制性核酸內(nèi)切酶降解樣本中DNA，再經(jīng)凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)印到固相支持物上，

3、用探針（DNA/DNA雜交）進行檢測的方法 。用于基因組DNA特異性序列定位、檢測目標DNA。Northern blot: 應用DNA探針檢測特異mRNA的一種雜交技術。用于研究特異性mRNA分子在細胞處于不同條件下發(fā)生量和質(zhì)的變化，或不同組織器官中基因表達的差異。,Southern blot,蛋白質(zhì)印跡-Western blot,將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質(zhì)檢測方法將獲得的蛋白質(zhì)樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠

4、電泳(SDS-PAGE)，對不同分子量的蛋白質(zhì)進行分離，再將凝膠上分離到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至固相支持物（NC膜或PVDF 膜）上，用特異性抗體（一抗）與膜上的靶蛋白進行特異性結(jié)合，再加入與一抗特異性結(jié)合帶有標記的二抗(HRP/AP)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影，檢測被檢生物樣本中目的基因蛋白表達情況,Western blot,三種印跡技術的比較,原位雜交(in situ hybridization, ISH),將特定標記的已知順序核酸為探針與細

5、胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。為研究單一細胞中DNA和編碼各種蛋白質(zhì)、多肽的相應mRNA的定位提供了手段，使從分子水平研究細胞內(nèi)基因表達及有關基因調(diào)控提供了有效的工具 。,菌落原位雜交與熒光原位雜交(FISH),生物芯片(biochip),將核酸、多肽或蛋白質(zhì)分子、組織切片和細胞等制成探針，以預先設計的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等載體上，構(gòu)成二維分子列陣，與待測生物樣本靶分子雜交，通過

6、檢測信號實現(xiàn)快速、高效、高通量樣本檢測。,微列陣芯片(microarray chip),基因芯片(DNA microarray)：將cDNA或寡核苷酸按微陣列方式固定在微型載體上，以此為探針與待測樣品中基因雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來實現(xiàn)對靶序列信息的快速檢測和分析。蛋白質(zhì)芯片(protein microarray )：將已知的多肽、蛋白質(zhì)按微陣列方式固定在微型載體上，利用抗原與抗體、受體與配體、酶與底物、蛋白與其他小分子間相

7、互作用，檢測分析多肽、蛋白質(zhì)的一項技術。,微列陣芯片(microarray chip),細胞芯片：在芯片上完成對細胞的捕獲、 固定、 平衡、 運輸、 刺激及培養(yǎng)等精確控制，并通過微型化的化學分析方法， 實現(xiàn)對細胞樣品的高通量、 多參數(shù)、 連續(xù)原位信號檢測和細胞組分的理化分析等研究目的。組織芯片：將不同生物體的組織按預先設計或研究需要排列在固相載體山所形成的組織微列陣。,基因芯片,目的基因制備技術,聚合酶鏈式反應(polymerase

8、chain reaction, PCR)：在體外由引物介導的、酶促快速合成擴增特定基因或DNA片段的一種方法。cDNA文庫(cDNA library):某一生物特定器官或特定發(fā)育階段的細胞內(nèi)總mRNA，應用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此構(gòu)建的重組DNA克隆群?；瘜W合成：序列已知的較短目的基因,聚合酶鏈式反應(PCR),原理：以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶作用下，以dNTPs為底物

9、，按照半保留復制原理，通過變性、退火、延伸三個步驟不斷重復完成新DNA合成。PCR體系的基本成分：模板、特異性引物、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP)、二價陽離子(Mg2+)、緩沖液、一價陽離子,PCR的基本步驟,變性：雙鏈DNA解離成為單鏈(94℃)退火(復性)：引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合（50 ℃ 左右）延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿

10、基配對原則，合成一條新的互補鏈 （70 ℃ 左右）,PCR的應用,研究—目的基因的擴增、基因克??；DNA測序；基因功能和表達調(diào)控的研究、分析突變診斷—細菌、病毒、寄生蟲檢測及診斷人類基因組工程—遺傳圖譜的構(gòu)建；DNA測序；表達圖譜法醫(yī)—犯罪現(xiàn)場標本分析、親子鑒定腫瘤—各種腫瘤檢測其他……,cDNA文庫,基本原理：用Oligo(dT)作為逆轉(zhuǎn)錄引物，或使用隨機引物，以提取的總mRNA為模板，進行逆轉(zhuǎn)錄PCR，合成的cDNA連接到

11、適當?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化后獲得包含cDNA的克隆群?；静襟E：(1)提純獲取高質(zhì)量的mRNA; (2)cDNA第一條鏈的合成; (3) cDNA第二條鏈的合成; (4) 雙鏈cDNA的修飾; (5) 雙鏈cDNA的分子克隆; (6) cDNA文庫的擴增; (7) cDNA文庫鑒定評價。,cDNA文庫的優(yōu)越性,在基因組水平上研究某基因?qū)ζ鞴俳M織和細胞在個體發(fā)育中的影響cDNA文庫的篩選比較簡單易行，尤其適用于某些特殊組織基因的制備由于每一個

12、cDNA克隆都包含一種mRNA序列，在篩選中出現(xiàn)假陽性的概率降低為了測定mRNA序列，利用它的cDNA拷貝序列就可以有效分析外顯子的基因結(jié)構(gòu),化學合成,作為核酸分子雜交探針作為測序及PCR的引物制備較小的基因或天然來源不易得到的完整基因或用于改造天然基因作為DNA末端改造中的接頭、引入酶切位點用于基因定位及位點專一性改變,基因敲除技術(Gene knockout),外源DNA與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，

13、從而代替受體細胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細胞的基因組中。 原理與基本操作:(1)ESCs(embryo stem cells)的獲得;(2)基因載體的構(gòu)建;(3)目的基因?qū)?(4)同源重組ESC的篩選;(5)靶細胞導入小鼠體內(nèi);(6)表型研究;(7)得到純合體,,基因敲除小鼠的產(chǎn)生原理,RNA干擾技術,RAN干擾(RNA interference, RNAi):外源和內(nèi)源性雙鏈RNA(double-strand R

14、NA, dsRNA)在生物體內(nèi)誘導同源靶基因的mRNA特異性降解，導致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的技術。RNAi的作用機制:RNA誘導的DNA甲基化：RNA被降解為21-23nt小片段，特異性誘導同源序列DNA甲基化。dsRNA誘導的RNAi作用。,dsRNA誘導的RNAi作用機制,起始階段：dsRNA被Dicer加工裂解為21-23nt的siRNA效應階段：siRNA與解旋酶、ATP、多種蛋白質(zhì)形成RISC，結(jié)合并切割靶mRNA,RNAi

15、的作用特點,高度特異性高效性受多基因控制需要siRNA介導對靶基因位點具有選擇性具有放大效應,siRNA的設計與制備,設計原則: (1)從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點;(2)盡量避免5‘和3’端的非編碼區(qū)；(3)siRNA序列的GC含量應為30%-50%左右;(4)將挑選的序列在公共數(shù)據(jù)庫中進行比較以確保目的序列與其它基因沒有同源性。