分子生物學(xué)常用技術(shù)雜交_第1頁
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文檔簡介

1、分子生物學(xué)常用技術(shù),凝膠電泳,分子雜交技術(shù),PCR 技術(shù),DNA 物理圖譜 DNA序列測定 生物芯片,“基因靶向”技術(shù),RNA干擾技術(shù),分子雜交技術(shù),,,,核酸分子雜交 是在DNA變性和復(fù)性的基礎(chǔ)上建立起來的一種分子 生物學(xué)技術(shù). 其原理是具有一定同源性的兩條核 酸單鏈在一定條件下根據(jù)堿基互補的原則可以形 成雙鏈(堿基對之間非共價健形成穩(wěn)定的雙鏈).,雜交(hy

2、dridization)指兩個以上的分子因具有 相近的化學(xué)性質(zhì)(或結(jié)構(gòu)互補)而在適宜的 條件下特異地相互識別、結(jié)合形成雜交體 (hybrid)的過程。,(一)DNA變性 DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂,雙螺旋解開,形成 單鏈無規(guī)則線團樣DNA,稱為DNA變性。 變性方法:1): 加熱、

3、 2): DNA溶液的pH改變、 3): 有機溶劑等 變性的DNA的特征:粘度下降、沉降速度增加、 浮力上升、紫外吸收增加。 (二)DNA復(fù)性 變性DNA只要消除變性條件,二條互補鏈還可以重新結(jié) 合,恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu),這一過程

4、稱為復(fù)性。復(fù)性 后的DNA,理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。,核酸分子雜交的特點: 高度特異性 高度靈敏性已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù).廣泛應(yīng)用于: 基因克隆的篩選 酶切圖譜的制作 基因序列的定量和定性分析 基因突變的檢測等。,雜交

5、的雙方 : 待測核酸序列 +探針(probe)待測核酸序列: 克隆的DNA片段 未克隆化的基因組DNA 細胞總RNA, mRNA。,核酸分子雜交,核酸探針:是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標記而便于檢測的,能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補的已知DNA或RNA片段。 基因組DNA探針 cDNA探針 寡

6、核苷酸探針 RNA探針等,探 針,1、DNA探針  DNA探針是最常用的核酸探針,指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。現(xiàn)已獲得DNA探針種類很多: 有細菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列,或某一非編碼序列。,來源: 分子克隆 PCR,2、cDNA 探針   cDNA (complementary DNA)探針

7、是指互補于mRNA的DNA分子,是由逆轉(zhuǎn)錄酶催化而產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板,根據(jù)堿基配對原則,按照RNA的核苷酸順序合成DNA(其中U與A配對) 。 無內(nèi)含子和非編碼序列 cDNA 探針是目前應(yīng)用最為廣泛理想的一種探針。,來源: 分子克隆 RT- PCR,DNA探針(包括cDNA探針)的優(yōu)點:    ①: 這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中,可以無限繁殖、大量制備、方法簡便

8、。  ?、? 不易降解(相對RNA而言),DNA酶活性一般能有效抑制。    ③: DNA探針的標記方法較成熟,有多種方法可供選擇,如缺口平移,隨機引物法等,能用于同位素和非同位素標記。,3、RNA探針:   RNA探針是一類很有前途的核酸探針,由于RNA是單鏈分子,所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高,特異性強。 克隆載體體外轉(zhuǎn)錄(in vitro transcription) RNA探針 容易降

9、解,4、寡核苷酸探針:    根據(jù)已知的核酸序列,采用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段,亦可作為探針使用。若不知核酸序列,可根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推倒出核酸順序,但要考慮到密碼子的兼并性。多用于克隆篩選和點突變分析。   人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點:  ?、俣痰奶结槺乳L探針雜交速度快、穿透力強。  ?、诳梢栽诙虝r間內(nèi)大量制備。  ?、墼诤铣芍羞M行標記制成探針。  ?、芸珊铣蓡捂溙结槪?/p>

10、免了用雙鏈DNA探針在雜交中自我復(fù)性,提高雜交效率。  ?、莨押塑账崽结樋梢詸z測小DNA片段,在嚴格的雜交條件下,可用于檢測在序列中單堿基對的錯配。,人工合成的寡核酸探針有下述優(yōu)點:   ①短的探針比長探針雜交速度快、穿透力強。  ?、诳梢栽诙虝r間內(nèi)大量制備。  ?、墼诤铣芍羞M行標記制成探針。  ?、芸珊铣蓡捂溙结?,避免了用雙鏈DNA探針在雜交中自我復(fù)性,提高雜交效率。   ⑤寡核苷酸探針可以檢測小DNA片段,在嚴格的雜交

11、條件下,可用于檢測在序列中單堿基對的錯配。,篩選寡核苷酸針的原則 :    ①長18~50bp,較長探針雜交時間較長合成量低;較短探針特異性會差些。  ?、趬A基成分:G+C含量為40%~60%,超出此范圍則會增加非特異雜交。  ?、厶结樂肿觾?nèi)不應(yīng)存在互補區(qū),否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。  ?、鼙苊鈫我粔A基的重復(fù)出現(xiàn)(不能多于4個),如-CCCCC-。   ⑤一旦選定某一序更符合上述標準,最好將序列與核酸文庫中核酸

12、序列比較,探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交,而與非靶區(qū)域的同源性不能超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基的同源,否則,該探針不能用。,克隆探針:   前述三種探針(DNA, cDNA, RNA)均是可克隆的,一般情況下,只要有克隆的探針,就不用寡核苷酸探針。克隆探針的優(yōu)點: (1): 特異性強,從統(tǒng)計學(xué)角度而言, 較長的序列復(fù)雜度高,隨機碰撞互補序列的機會較短序列少; (2): 可獲得較強的雜交信號,因為

13、克隆探針較寡核苷酸探針摻入的可檢測標記基團更多。,核酸探針的標記,核酸探針的制備是分子雜交技術(shù)的關(guān)鍵,放射性同位素標記: 敏感度高 輻射危害 最早采用, 最常用的核酸探針標記方法。 常用同位素: 32P、35S。 32P因其能量高,信號強,所以最常用。 半衰期: 32P為14.3

14、天、35S為87.1天、 125I為60天、3H為12.3年,核酸探針的常用酶促標記技術(shù)有: 缺口平移 DNA快速末端標記 用T4多核苷酸酶標記DNA 5'末端 隨引物延伸 聚合酶鏈反應(yīng),缺口平移,DNA快速末端標記;3 ‘末端,隨引物延伸

15、,非放射性標記物有下述幾類:金屬如Hg熒光物質(zhì)如F2TC半抗原如地高辛、生物素酶類如辣根過氧化物酶(HRP)、半乳糖苷酶或堿性磷酸酶(AKP)等不同的標記物,所標記探針的方法及檢測方法也各異。,固相雜交: 將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上,一條反應(yīng)核酸鏈游離在溶液中,支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。 優(yōu)點: 1):未雜交的游離片段可容易地漂洗除去,2): 膜上留下的雜交

16、物容易檢測, 3):能防止靶DNA自我復(fù)性等。 常用類型有:菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、 Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。 液相雜交: 參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。核糖核酸酶保護分析(Ribonuclease Protection Assay,RPA)等,核酸分子雜交方法,Southern 印跡雜交,1975年,英國Southern創(chuàng)建DNA +

17、 DNA雜交: 即將待測DNA酶切、電泳、轉(zhuǎn)移(印)并固定在固相支持物上,用已知DNA探針進行檢測的方法。,用途: 1): 基因定性定量 2): DNA物理圖譜 3): 基因變異重排 4): 基因限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性分析(RFLP) 5): 疾病診斷,探針: DNA探針,Southern印跡雜交,Southern 雜交(Southern blotting)的主要步驟,待測DNA樣品的制備、酶切待測DNA 樣

18、品的電泳分離:瓊脂糖凝膠電泳凝膠中DNA的變性:堿變性Southern轉(zhuǎn)膜:硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜毛細管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法探針的制備 Southern雜交雜交結(jié)果的檢測,1.DNA的變性解鏈: 數(shù)倍體積的1.5mol/L  NaCl和0.5mol/L NaOH中1小時2. 中和: 然后用數(shù)倍體積的1mol/L Tris-HCl (pH8.0)和1.5mol/L NaCl溶液中和1小時

19、3.轉(zhuǎn)移: 變性DNA在硝酸纖維素膜, 尼龍膜上的固定。硝酸纖維素濾膜(孔徑0.45um)用6SSC浸泡30min,DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后,然后再在80℃真空干燥2h or UV cross link。 4.預(yù)雜交: 預(yù)熱至60℃的預(yù)雜交液(6×SSC,0.5%SDS,5×Denhardt液,100μg/ml鮭魚精DNA)。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理,調(diào)濃度至10μg/ml,用前放1

20、00℃水溶液中煮沸變性10min,,Southern轉(zhuǎn)膜變性雜交:,5.雜交:  盡可能擠凈預(yù)雜交液,溶液的組成是6×SSC,0.01mol/L   EDTA,變性的標記核酸探針,5×Denhardt液,0.5%SDS,100mg/ml變性的鮭魚精DNA。雜交反應(yīng)在68℃水浴中進行,時間一般為4-20h。   6.洗膜: 2×SSC和0.5% SDS溶液室溫下漂洗

21、5min, 2×SSC和0.1% SDS中,室溫下洗滌15分鐘(輕輕搖動), 0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃輕輕搖動保溫2h,洗脫的溫度一般應(yīng)控制在Tm值12℃以下,[Tm=69.3+0.41×(G+C)%] 。   7.結(jié)果顯示: 放射自顯影法,只需將雜交膜與X光片在暗盒中暴光數(shù)小時至數(shù)天,再顯影,定影即可. 暴光通常在-20℃或- 80 ℃, Phosphori

22、mage定量,,,轉(zhuǎn)移緩沖液,,,121204 cell clones DNA digested with EcoRI,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 m 11 12 13 14 15 16 17 18 19,1: 12: 33: 124: 385: 406: 417: 568: 639: 6510: 67M: 1kb marker11: 7412: 7513: 76

23、14: 7715: 7816: 9517: 9818: 10119: 235,Assay the copy number of provirus in HT1080 with Southern blot,19 18 17 16 15 14 13 12 11 M 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1,1: 12: 3

24、3: 124: 385: 406: 417: 568: 639: 6510: 67M: 1kb ladder11: 7412: 7513: 7614: 7715: 7816: 9517: 9818: 10119: 235,121004 cell clones DNA digested with EcoRI,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 m 11 12 13

25、 14 15 16 17 18 19,1: 542: 963: 974: 2245: 2316: 2327: 2338; 235/nondigested9: 23610: 239M: 1kb ladder11: 24012: 24413: 24514: 24815: 25216: 28617: 29018: 30119: 313,Assay the copy number of provirus i

26、n HT1080 with Southern blot,19 18 17 16 15 14 13 12 11 M 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1,1: 542: 963: 974: 2245: 2316: 2327: 2338; 235/undigested9: 23610: 239M: 1kb marker

27、11: 24012: 24413: 24514: 24815: 25216: 28617: 29018: 30119: 313,Northern印跡雜交(Northern blotting),這是一種將待測RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印并固定到膜上、然后再與已知的DNA或RNA探針雜交的方法。 DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建,稱為Southern印跡技術(shù),RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)

28、,故被稱為Northern印跡雜交。,Northern  印跡雜交的RNA轉(zhuǎn)移與Southern印跡雜交的DNA轉(zhuǎn)移方法類似,只是在進樣前用甲基氫氧化銀、乙二醛或甲醛使RNA變性,而不用NaOH,因為它會水解RNA的2'-羥基基團。,RNA + DNA /RNA雜交,用途: 1): 基因表達(mRNA)定性定量 2): transcripts(mRNA) splicing,探針: DNA、RNA 探針,Nor

29、thern印跡雜交,Northern blotting,RNA甲醛凝膠電泳和吸印方法 1. 試劑: 10×MSE緩沖液:0.2mol/L嗎啉代丙烷磺酸(MOPS),pH7.0,50mmol/L醋酸鈉,1mmol/L   EDTA  pH8.0。 5×載樣緩沖液:50%甘油,1mmol/L EDTA,0.4%溴酚藍。 甲醛:用水配成37%濃度(12.3mol/L),應(yīng)

30、在通風(fēng)柜中操作,pH高于4.0。 20×SSC; 去離子甲酰胺; 50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl); 0.1mol/L Tris,pH7.5。,2.電泳步驟: (1)40ml水中加0.7g瓊脂糖,煮沸溶解,冷卻到60℃,加7ml10×MSE緩沖液, 11.5ml 甲醛,加水定容至70ml,混勻后倒入盛膠槽。 (2)等膠凝固后,去掉梳子和膠布,將盛膠槽放入1×MSE緩沖

31、液的電泳槽。 (3)使RNA變性(最多20μg),RNA4.5ul,10×MSE緩沖液2ul,甲醛3.5ul,去離子甲酰胺10ul。 (4)55℃加熱15min,冰浴冷卻。 (5)加2ul5×載樣緩沖液。,(6)上樣、同時加RNA marker/ladder。 (7)60伏電泳過夜。 (8)取出凝膠,水中浸泡2次,每次5min。 (9)將膠浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L N

32、aCl中45min, 水解高分子RNA,以增強轉(zhuǎn)印。 (10)將膠浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使膠中和。 (11)20×SSC洗膠1h。 (12)20×SSC中過夜轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。 (13)取出硝酸纖維素膜,80℃真空烘烤2 h,Northern blot 與Southern blot 相似,轉(zhuǎn)移方法與雜交程序:,042506A RNA

33、 gelling for single copy HT1080 clones,M 1080 24 96 107 115 206 228 241 243,M 1080 24 96 107 115 206 228 241 243,28S,18S,RNA splicing,核糖核酸酶保護分析(Ribonuclease Protection Assay,RPA)是一種高通量,各項指標均優(yōu)于傳統(tǒng)Northern Blotin

34、g的mRNA定量檢測技術(shù)。 利用32P-(放射法)或生物素(非放法)標記由多個目標基因的DNA模板體外轉(zhuǎn)錄出的長短不一的反義RNA探針,將含過量探針的溶液與樣品總RNA雜交,經(jīng)核糖核酸酶(RNase)處理后,未與探針雜交的單鏈RNA和過量的游離探針被降解,而目標RNA則因與探針結(jié)合形成雙鏈而被‘保護’,則雜交雙鏈RNA的量代表了樣本中相應(yīng)基因的表達量。,核糖核酸酶保護分析,液相雜交,信號檢測:

35、對于放射性RPA,雜交雙鏈進行變性聚丙酰胺凝膠電泳,用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測被保護的探針的信號。 對于非放的RPA,雜交雙鏈經(jīng)過變性聚丙酰胺凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至尼龍膜,UV照射使被保護的RNA探針與膜交聯(lián)而固定,再用試劑盒提供的鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP)和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標記的探針結(jié)合,這樣,再將膜放入暗盒中暴露于X射線膠片或者用CCD照相機檢測雜交探針的信號。 根據(jù)適

36、當大小的探針片斷的信號強度來定量待測樣本中該探針RNA代表的基因表達水平。,放射性RPA,放射性非放的RPA,凝膠真空干膠器,用于電泳后凝膠的干燥干燥時間:20-40min,RPA vs Northern Blot 之優(yōu)勢: 1): 過量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成, 反應(yīng)更加完全 2): RPA比Northern Blot靈敏15-150倍,適合檢測 各種表達水平之基因 3): RPA通量高,

37、同時檢測多個基因,可評價他們在 同一情況下的差異表達 4): 快速, 一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作,加快研究速度,1.菌落原位雜交(colony in  situ hybridization) 是將細菌從一主平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后將濾膜上的菌落裂菌以釋放出DNA,將DNA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交,放射自顯影檢測菌落雜

38、交信號、并與主平板上的菌落對位。,實驗步驟如下:① Master plate: 將硝酸纖維素濾膜置于含抗生素 的平皿瓊脂培養(yǎng)基上,用無菌牙簽挑取單菌落種 于濾膜和主瓊脂平板上,排列成方格柵,膜和板 上菌落位置相同。 ② 培養(yǎng)細菌至產(chǎn)生1-2mm大小的菌落。 ③ 在一塊平皿中置4張濾紙,用10%SDS浸透,倒掉 多余液體,將帶有菌落的濾膜取下輕輕置于濾紙 上,菌落面在上,注意防止濾膜底面存有氣泡。

39、,,,Master plate,④ 5min后,將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液(0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl)浸濕的濾紙上,放置10min。 ⑤ 將濾膜轉(zhuǎn)至中和溶液(1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L Tris-HCl pH8.0)浸濕的濾紙上,放置10min,重復(fù)中和一次。 ⑥ 將濾膜移至用2×SSPE溶液浸過的濾紙上,放置10min,SSPE配成20×貯備液:3.6mol/L

40、NaCl,0.2mol/L NaH2PO4(pH7.4),20mmol/L EDTANa2(pH7.4)。 ⑦ 將濾膜用濾紙吸干,80℃真空烘干2h。,菌落原位雜交,菌落原位雜交,斑點雜交:是將被檢DNA/RNA點到膜上,烘烤固定。這種方法耗時短,可做半定量分析。一張膜上可同時檢測多個樣品,為使點樣準確方便,市售有多種多管吸印儀(Manifold),如MinifoldⅠ和Ⅱ、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它

41、們有許多孔,樣品加到孔中,在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。膜烤干或紫外線照射以固定標本。,2.斑點雜交(Dot blot)。,(1)DNA斑點雜交: ①先將膜在水中浸濕,再放到15×SSC中。 ②將DNA樣品溶于水或TE,煮沸5min,冰中速冷。 ③用鉛筆在濾膜上標好位置,將DNA點樣于膜上, 5μl(2~10μg DNA)。

42、 ④將膜烘干,密封保存?zhèn)溆谩?(2)RNA斑點雜交: 每個樣品至多加10μg總RNA溶于5μl DEPC水, 加 5μl甲醛/SSC緩沖液(10×SSC中含6.15mol/L甲 醛),使RNA變性,然后取5-8μl點樣于處理好的濾膜 上,烘干。,5.組織原位雜交(Tissue in situ hybridization)

43、 組織原位雜交簡稱原位雜交,指組織或細胞的原位雜交,它與菌落原位雜交不同,菌落原位雜交需裂解細菌釋出DNA,然后進行雜交,而組織原位雜交是經(jīng)適當處理后,使細胞通透性增加,讓探針進入細胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。,原位雜交的探針: 單鏈或雙鏈DNA,RNA。長度:100-400nt,過長則雜交率減低。寡核苷酸探針(16-30 nt)能自由出入細菌和組織細胞壁,雜交效率明顯高于長探針. 寡核苷酸探針

44、, 小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標記的RNA探針是組織原位雜交優(yōu)選探針。,原位雜交程序:,組織細胞的固定 預(yù)雜交 雜交 沖洗 放射自顯影 / 免疫酶法顯色以顯示雜交結(jié)果,,,,,原位雜交可以確定探針互補序列在胞內(nèi)的空間位置,這一點具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。 1): 對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示按規(guī)定序列的位置,對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能

45、排布; 2): 與細胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細胞中和組織中的分布。此外, 3):原位雜交還是顯示細胞亞群分布和動向 4): 病原微生物存在方式和部位。,組織原位雜交用途:定位, 定量,Western blot,原理: Western Blot與Southern或Northern雜交方法類似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質(zhì),“探針”是抗

46、體,“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。,斯坦福大學(xué)的喬治·斯塔克(George Star

47、k)。在尼爾·伯奈特(Neal Burnette)于1981年所著的《分析生物化學(xué)》(Analytical Biochemistry)中首次被稱為Western Blot。,蛋白質(zhì),抗體,酶或同位素標記的第二抗體,底物顯色或放射自顯影,+,+,,分類Western Blot顯色的方法主要有以下幾種:i. 放射自顯影ii. 底物化學(xué)發(fā)光ECLiii. 底物熒光ECFiv. 底物DAB呈色現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL

48、和底物DAB呈色,體同水平和實驗條件的是用第一種方法,目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行,操作也比較簡單,原理如下(二抗用HRP標記):反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾,如遇到HRP,即發(fā)光,可使膠片曝光,就可洗出條帶。,電泳印跡,電泳轉(zhuǎn)移即電泳印跡。它是利用低電壓,大電流的直流電場使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉(zhuǎn)移到特定的膜上 。,電泳槽,適用于將凝膠電泳的圖譜轉(zhuǎn)移到固相轉(zhuǎn)移膜上DF-9夾芯電泳槽 可做各種凝

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