鋅離子對蛋白磷酸酯酶2A的調(diào)節(jié)及其在阿爾茨海默病中的作用.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’sDisease,AD)是最常見的老年性癡呆癥,其主要病理學改變是腦內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFTs)和老年斑(SP)的形成。NFTs的主要成分是過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau,異常磷酸化的tau喪失其促微管組裝和穩(wěn)定微管的功能,并聚集成為成對螺旋絲(PHF),最終導致NFT的形成、突觸的退變和神經(jīng)元的丟失,在AD的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。而tau的磷酸化主要受相關(guān)蛋白激酶(proteinkinases,PK

2、)和蛋白磷酸酯酶(proteinphosphatases,PP)的調(diào)節(jié)。大量的研究事實表明,蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)的活性在阿爾茨海默病人腦中下降并參與AD樣tau蛋白異常磷酸化的形成,但導致PP2A活性下降的上游因素和機制尚未闡明。
　　鋅(Zn)離子,是腦內(nèi)含量較為豐富的微量元素之一,參與神經(jīng)傳導,抗氧化反應,并調(diào)節(jié)多種酶和生長因子的活性。大量研究結(jié)果表明,胞外鋅離子水平增高可導致多種蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸磷酸化修飾。前期研究結(jié)

3、果顯示PP2A催化亞單位酪氨酸307位點(Y307)磷酸化后可明顯抑制PP2A活性,而在AD易感腦區(qū)鋅離子水平增高,提示鋅離子可能參與了AD腦內(nèi)PP2A活性的下調(diào)而促進tau蛋白過度磷酸化。且到目前為止Zn對PP2A的調(diào)節(jié)及機制尚無報道。
　　我們在本研究中重點探討了鋅離子對PP2A的調(diào)節(jié)及其在tau過度磷酸化中的作用,并且從分子水平解釋了Zn對PP2A的直接和間接抑制作用機制。主要結(jié)果如下:
　　第一部分鋅離子通過激活Sr

4、c途徑抑制PP2A活性和導致tau蛋白過度磷酸化
　　蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)的活性在阿爾茨海默病(AD)人腦中下降并參與AD樣tau蛋白異常磷酸化的形成,但導致PP2A活性下降的上游因素和機制尚未闡明。有文獻報道顯示,PP2A催化亞基的酪氨酸307位點(Y307)磷酸化修飾是導致PP2A失活的直接原因,但何種機制促使PP2A發(fā)生失活性修飾還不清楚。大量研究結(jié)果表明,胞外鋅離子水平增高可導致多種蛋白質(zhì)發(fā)生酪氨酸磷酸化修飾,而在

5、AD易感腦區(qū)鋅離子水平增高,提示鋅離子可能參與了AD腦內(nèi)PP2A活性的下調(diào)而促進tau蛋白過度磷酸化。
　　【目的】闡明鋅離子是否通過調(diào)節(jié)PP2A活性促進tau蛋白異常過度磷酸化及調(diào)節(jié)PP2A活性的機制。
　　【材料和方法】實驗在整體和細胞水平進行。整體水平采用雄性SD大鼠,側(cè)腦室定位注射硫酸鋅,分組如下:生理鹽水對照組、30mM硫酸鋅給藥組,30mM硫酸鋅給藥+鋅離子特異性螯合劑CQ腹腔注射組。在側(cè)腦室注射6天后,麻醉取腦

6、分離海馬組織勻漿,用免疫印跡檢測tau磷酸化水平的變化,以及PP2AcY307磷酸化水平的變化,檢測PP2A的活性;細胞水平采用小鼠成神經(jīng)瘤N2a細胞系,用100μM硫酸鋅處理3小時后提取蛋白,同樣方法檢測PP2AcY307磷酸化及tau磷酸化水平。同時在細胞水平給予PP2或DES預孵育30min或轉(zhuǎn)染野生型PP2A和突變性PP2A,在用用100μM硫酸鋅處理3小時后提取蛋白,同樣方法檢測PP2Ac磷酸化及tau磷酸化水平。在轉(zhuǎn)基因動物

7、水平,我們采用轉(zhuǎn)人tau的轉(zhuǎn)基因小鼠,鋅離子螯合劑CQ灌胃35天,檢測PP2Ac磷酸化及tau磷酸化水平及可溶性tau和不溶性tau的變化情況。
　　【結(jié)果】將鋅離子直接注射入整體動物側(cè)腦室,6天后海馬PP2AcY307磷酸化水平明顯增高,伴隨PP2A活性下降,tau蛋白在多個絲氨酸/蘇氨酸位點如Ser214、Thr205、Ser396、Ser404發(fā)生過度磷酸化;給動物同時腹腔注射鋅離子螯合劑CQ,則可部分逆轉(zhuǎn)PP2AcY307

8、磷酸化水平和PP2A活性的抑制。用硫酸鋅處理小鼠成神經(jīng)瘤N2a細胞,同樣導致PP2Ac發(fā)生酪氨酸磷酸化修飾和活性下降,tau蛋白在多個位點發(fā)生過度磷酸化,伴隨Src失活性磷酸化位點酪氨酸529(Tyr529)磷酸化水平降低,Src激活。給予鋅同時給予PP2A的激動劑或過表達野生型PP2A可逆轉(zhuǎn)鋅導致的PP2Ac活性下降以及tau蛋白的過度磷酸化。給予Src家族的特異性抑制劑PP2同樣可部分逆轉(zhuǎn)PP2AcY307磷酸化和PP2A活性的抑制

9、以及tau蛋白的磷酸化。轉(zhuǎn)基因小鼠的給予鋅離子螯合劑CQ灌胃后,Src活性抑制,PP2AcY307磷酸化水平降低,PP2A活性抑制和tau蛋白磷酸化被逆轉(zhuǎn),伴隨海馬內(nèi)不可溶性tau水平明顯下降,
　　【結(jié)論】鋅離子可通過激活Src而對PP2A進行酪氨酸磷酸化修飾下調(diào)PP2A活性,從而導致tau蛋白發(fā)生過度磷酸化,促進AD樣病變的形成。干預tau轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)鋅離子水平可上調(diào)PP2A活性并降低tau蛋白的磷酸化水平。因此干預鋅離子水

10、平有可能成為在體上調(diào)PP2A活性的新策略。
　　第二部分鋅離子體外直接抑制PP2A活性及機制研究
　　我們已經(jīng)在第一部分闡明鋅離子在整體動物腦和細胞內(nèi)可通過激活Src而使PP2AY307磷酸化失活和tau蛋白過度磷酸化。那么在體外鋅離子對PP2A是否有直接調(diào)節(jié)作用?其內(nèi)在機制是什么到目前為止尚無報道。
　　【目的】闡明鋅離子直接調(diào)節(jié)PP2A活性及其內(nèi)在機制。
　　【材料和方法】收集培養(yǎng)的N2a細胞并裂解,在不加入

11、ATP的情況下直接將細胞裂解液和100μM硫酸鋅或10nM岡田酸(OA)孵育0,5,15,30min,用免疫印跡檢測tau磷酸化水平的變化。同樣的方法用不同濃度(0,10,50,100μM)硫酸鋅與細胞裂解液共孵育不同時間(0,5,15,30,60min),檢測PP2A活性。構(gòu)建不同片段的PP2Ac原核表達質(zhì)粒并純化,將純化的GST-PP2AR1-50R、PP2AR51-270R和PP2AR271-309R分別和100μM硫酸鋅孵育,檢

12、測PP2A活性。最后我們用親和層析柱(IDA)預先孵育硫酸鋅或不孵育硫酸鋅,分別讓純化的GST-PP2AR1-50R、GST-PP2AR51-270R和GST-PP2AR271-309R自然流過IDA柱,然后用EDTA洗脫,收集不同組分的液體用免疫印跡檢測GST的變化以確定不同片段PP2Ac與Zn的結(jié)合情況。
　　【結(jié)果】將硫酸鋅和細胞裂解液共孵育可延緩tau蛋白發(fā)生去磷酸化的進程,共孵育15min時已和強PP2A抑制劑岡田酸具有

13、同等的抑制tau蛋白去磷酸化的效果,同時隨著時間和硫酸鋅濃度的變化,PP2A的活性被抑制,在10μM,30min時到達最低水平,抑制率下降30％。而且給予硫酸鋅10μM時,PP2A的抑制效應有時間依賴性。說明在體外鋅離子直接抑制PP2A活性。為了進一步確定鋅離子對PP2A的直接抑制作用,將截斷的PP2A與鋅離子直接孵育發(fā)現(xiàn)鋅離子可以直接抑制GST-PP2AR51-270R片段的活性。通過IDA實驗發(fā)現(xiàn),鋅離子僅和GST-PP2AR51-