PTEN磷酸化在幽門(mén)螺桿菌致病中的作用.pdf

1、背景和目的:
　　胃癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤。近年來(lái)，隨著生活方式的轉(zhuǎn)變和診療水平的提高，其全球發(fā)病率和死亡率雖較前已有所下降，但仍是第4位常見(jiàn)的惡性腫瘤，男、女性死亡率分別占癌癥相關(guān)死亡的第3位和第5位，且大部分的新發(fā)病例都集中在我國(guó)等發(fā)展中國(guó)家。目前只有早期患者才可望通過(guò)手術(shù)治愈，而大多數(shù)病例確診時(shí)已處晚期，治療方法有限、預(yù)后不佳。為此，明確胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，探索胃癌早期診斷及基因治療新方法有重要意義。
　　PTEN是1

2、997年發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其編碼的蛋白質(zhì)具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重活性，通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt等信號(hào)通路在細(xì)胞增殖與凋亡、遷移與粘附和遺傳穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)，由于基因突變、雜合性缺失、啟動(dòng)子甲基化和microRNA調(diào)控等遺傳或表觀遺傳改變，胃癌中常存在PTEN失活。此外，PTEN的活性亦受到磷酸化調(diào)節(jié)，其磷酸化后將失去磷酸酶活性，但穩(wěn)定性增加，進(jìn)而失去抑癌功能，使腫瘤易感性增加。
　　目前認(rèn)為胃癌的發(fā)生通常經(jīng)

3、歷“正常胃黏膜→慢性非萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→胃癌”這一過(guò)程，Hp感染常在其中起始發(fā)和先導(dǎo)作用。而在胃黏膜癌變過(guò)程中，PTEN磷酸化狀態(tài)如何變化？PTEN磷酸化失活后是否可以通過(guò)影響Akt等下游靶因子，進(jìn)而引起細(xì)胞生物學(xué)功能異常？Hp感染在其中作用又如何？因此，針對(duì)這些未知，本課題通過(guò)體內(nèi)外研究探討胃黏膜癌變過(guò)程中PTEN磷酸化狀態(tài)的變化及其與Hp感染的關(guān)系，將為胃癌早期診斷及基因治療提供新思路，并進(jìn)一步闡明Hp致癌的可能機(jī)制

4、。
　　材料和方法:
　　1.收集15例胃癌及癌遠(yuǎn)端組織、4株胃癌細(xì)胞株(MKN28、MKN45、SGC-7901、AGS)及1株永生化正常胃黏膜上皮細(xì)胞株(GES-1)，行Westernblot檢測(cè)PTEN、p-PTEN的表達(dá)。
　　2.收集Hp陽(yáng)性和陰性的慢性非萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生和胃癌病理標(biāo)本（每組40例，其中Hp陽(yáng)性和陰性各20例，共160例），行免疫組化檢測(cè)PTEN、p-PTEN的表達(dá)。
　

5、　3.ATCC43504 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株感染蒙古沙鼠建立Hp感染動(dòng)物模型，同時(shí)以布氏肉湯灌胃的蒙古沙鼠作為對(duì)照組，收集末次灌胃6月和12月后胃黏膜標(biāo)本，行免疫組化檢測(cè)PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　4.ATCC43504 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株以MOI=50作用GES-1，同時(shí)以同體積細(xì)胞培養(yǎng)液作用的GES-1作為對(duì)照組，0、0.5、1、3、6、12h后，行Western blot檢測(cè)PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路

6、相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　5.PI3K抑制劑LY29400240μM預(yù)處理GES-11h，同時(shí)以同體積DMSO作用和未預(yù)處理的GES-1作為對(duì)照組，再以ATCC43504 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株MOI=50作用1h，行Western blot檢測(cè)PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　6.Akt抑制劑Akt i(Ⅷ)10μM預(yù)處理GES-11h，同時(shí)以同體積DMSO作用和未預(yù)處理的GES-1作為對(duì)照組，再以ATCC4350

7、4 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株MOI=50作用1h，行Western blot檢測(cè)PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　7.ATCC43504 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株以MOI=5、10、50、100作用GES-10、0.5、1、3、6、12h后，行MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率;ATCC43504 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株以MOI=50作用高表達(dá)各目的基因的胃黏膜細(xì)胞0、0.5、1、3、6、12h后，行MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率;ATCC43504 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株以

8、MOI=50作用Akt i(Ⅷ)10μM預(yù)處理1h后GES-10、0.5、1、3、6、12h，行MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率。
　　結(jié)果:
　　1.人胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中PTEN的磷酸化狀態(tài)
　　(1)以癌遠(yuǎn)端組織中PTEN、p-PTEN表達(dá)水平為自身對(duì)照，13例(13/15，86.7％)胃癌組織中PTEN表達(dá)水平低于癌遠(yuǎn)端組織(p＜0.001)，10例(10/15，66.7％)胃癌組織中p-PTEN表達(dá)水平低于癌遠(yuǎn)端組織(

9、p＞0.05)。
　　(2)將p-PTEN表達(dá)水平與PTEN表達(dá)水平相比，作為PTEN磷酸化比率，以癌遠(yuǎn)端組織中PTEN磷酸化比率為自身對(duì)照，10例(10/15，66.7％)胃癌組織中PTEN磷酸化比率高于癌遠(yuǎn)端組織(p＜0.05)。
　　(3)以GES-1細(xì)胞株中PTEN、p-PTEN表達(dá)水平為對(duì)照，MKN28、MKN45、SGC-7901、AGS細(xì)胞株中PTEN表達(dá)倍數(shù)分別為3.43±0.41(p＜0.001)、3.45

10、±0.25(p＜0.01)、3.25±0.39(p＜0.01)、2.22±0.21(p＜0.01)，p-PTEN表達(dá)倍數(shù)分別為4.60±0.36(p＜0.01)、19.5±1.39(p＜0.001)、18.9±1.68(p＜0.01)、7.96±0.32(p＜0.001)。
　　(4)將p-PTEN表達(dá)水平與PTEN表達(dá)水平相比，作為PTEN磷酸化比率，以GES-1細(xì)胞株中PTEN磷酸化比率為對(duì)照， MKN28、MKN45、SGC

11、-7901、AGS細(xì)胞株中PTEN磷酸化比率倍數(shù)分別為1.35±0.17(p＞0.05)、5.66±0.58(p＜0.01)、5.84±0.50(p＜0.01)、3.60±0.31(p＜0.01)。
　　2.人胃黏膜癌變過(guò)程中PTEN磷酸化狀態(tài)的變化及其與Hp感染的關(guān)系
　　(1) PTEN表達(dá)水平在慢性非萎縮性胃炎組最高，后隨胃黏膜病變的演化而降低，在胃癌組表達(dá)最低，各病變階段間表達(dá)有顯著性差異(p＜0.001)。將所有標(biāo)

12、本按Hp陽(yáng)性和陰性分兩組，Hp陽(yáng)性組和陰性組各病變階段PTEN表達(dá)亦呈現(xiàn)出類(lèi)似結(jié)果(p＜0.001、p＜0.05)。
　　(2) p-PTEN表達(dá)水平在慢性非萎縮性胃炎組最低，后隨胃黏膜病變的演化而升高，在腸上皮化生組表達(dá)最高，在異型增生組和胃癌組均有較高水平表達(dá)，各病變階段間表達(dá)有顯著性差異(p＜0.001)。將所有標(biāo)本按Hp陽(yáng)性和陰性分兩組，Hp陰性組各病變階段p-PTEN表達(dá)亦呈現(xiàn)出類(lèi)似結(jié)果(p＜0.001)，而Hp陽(yáng)性組各

13、病變階段p-PTEN均有較高水平表達(dá)，各病變階段間表達(dá)無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。
　　(3)PTEN表達(dá)在各病變階段Hp陽(yáng)性和陰性組間均無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，p-PTEN表達(dá)在腸上皮化生、異型增生和胃癌階段Hp陽(yáng)性和陰性組間亦無(wú)顯著性差異(p＞0.05)，而在慢性非萎縮性胃炎階段Hp陽(yáng)性組p-PTEN表達(dá)顯著高于Hp陰性組(p＜0.05)。
　　3.Hp感染對(duì)蒙古沙鼠胃黏膜PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

14、
　　(1)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中6月和12月兩亞組間PTEN表達(dá)水平均無(wú)明顯差異(p＞0.05)。按不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分為6月和12月兩組，6月和12月兩組中Hp感染與未感染亞組間PTEN表達(dá)水平亦無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　(2)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中12月亞組p-PTEN表達(dá)水平均顯著高于6月亞組(p＜0.001)。按不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分為6月和12月兩組，6月組中Hp感染與未感染亞組間p-PTEN表達(dá)水平無(wú)明顯差異(p＞0.05)

15、，而12月組中Hp感染亞組p-PTEN表達(dá)水平顯著高于未感染亞組(p＜0.001)。
　　(3)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中12月亞組PI3K表達(dá)水平均顯著高于6月亞組(p＜0.01)。按不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分為6月和12月兩組，6月和12月兩組中Hp感染與未感染亞組間PI3K表達(dá)水平則無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　(4)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中12月亞組Akt表達(dá)水平均顯著高于6月亞組(p＜0.001)。按不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分為6月和12月兩組，6

16、月和12月兩組中Hp感染與未感染亞組間Akt表達(dá)水平則無(wú)明顯差異(p=0.05、p＞0.05)。
　　(5)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中12月亞組p-Akt(Ser473)表達(dá)水平均顯著高于6月亞組(p＜0.05)。按不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分為6月和12月兩組，6月和12月兩組中Hp感染亞組p-Akt(Ser473)表達(dá)水平均顯著高于未感染亞組(p＜0.05)。
　　(6)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中12月亞組p-Akt(Thr308)表達(dá)水平均顯著高于6

17、月亞組(p＜0.05)。按不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分為6月和12月兩組，6月和12月兩組中Hp感染亞組p-Akt(Thr308)表達(dá)水平均顯著高于未感染亞組(p＜0.05)。
　　(7)實(shí)驗(yàn)組中12月亞組Bad表達(dá)水平顯著高于6月亞組(p＜0.05)，而對(duì)照組中12月亞組Bad表達(dá)水平與6月亞組無(wú)明顯差異(p＞0.05)。按不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分為6月和12月兩組，6月、12月組中Hp感染亞組Bad表達(dá)水平與未感染亞組均無(wú)明顯差異(p＞0.05)

18、。
　　(8)對(duì)照組中12月亞組p-Bad表達(dá)水平顯著高于6月亞組(p＜0.01)，而實(shí)驗(yàn)組中12月亞組p-Bad表達(dá)水平與6月亞組無(wú)明顯差異(p＞0.05)。按不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分為6月和12月兩組，6月組中Hp感染亞組p-Bad表達(dá)水平顯著高于未感染亞組(p＜0.05)，而12月組中Hp感染亞組p-Bad表達(dá)水平與未感染亞組無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　(9)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中12月亞組GSK3β表達(dá)水平與6月亞組均無(wú)明顯

19、差異(p＞0.05)。按不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分為6月和12月兩組，6月、12月組中Hp感染亞組GSK3β表達(dá)水平與未感染亞組均無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　(10)實(shí)驗(yàn)組中12月亞組p-GSK3β表達(dá)水平顯著高于6月亞組(p＜0.05)，而對(duì)照組中12月亞組p-GSK3β表達(dá)水平與6月亞組無(wú)明顯差異(p＞0.05)。按不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)分為6月和12月兩組，6月、12月組中Hp感染亞組p-GSK3β表達(dá)水平與未感染亞組均無(wú)明顯差異(p＞

20、0.05)。
　　4.Hp活菌對(duì)胃黏膜上皮細(xì)胞株P(guān)TEN/PI3K/Akt信號(hào)通路的影響
　　(1)Hp活菌以MOI=50作用GES-1不同時(shí)間后，PTEN表達(dá)水平無(wú)明顯變化(p＞0.05)，而p-PTEN表達(dá)水平在作用后0.5h即升高，1h達(dá)到高峰，12h內(nèi)均高于0h(p＜0.001)。而對(duì)照組PTEN、p-PTEN表達(dá)水平均無(wú)明顯變化(p＞0.05)。
　　(2) Hp活菌以MOI=50作用GES-1不同時(shí)間后，A

21、kt、Bad、GSK3β表達(dá)水平均無(wú)明顯變化(p＞0.05)，而p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)表達(dá)水平在作用后0.5h即升高，3h達(dá)到高峰，12h內(nèi)均高于0h(p＜0.001); p-Bad、p-GSK3β表達(dá)水平在作用后0.5h即增加，后逐漸升高，12h達(dá)到高峰(p＜0.001)。而對(duì)照組Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、Bad、p-Bad、GSK3β、p-GSK3β表達(dá)水平均無(wú)明

22、顯變化(p＞0.05)。
　　5.PI3K在Hp活菌激活胃黏膜上皮細(xì)胞株P(guān)TEN/PI3K/Akt信號(hào)通路中的作用
　　(1)Hp活菌以MOI=50作用GES-1不同時(shí)間后，PI3K表達(dá)水平無(wú)明顯變化(p＞0.05)，對(duì)照組PI3K表達(dá)水平亦無(wú)明顯變化(p＞0.05)。
　　(2) LY294002以40μM預(yù)處理GES-11h后，p-Akt(Ser473)(p＜0.001)、p-Akt（Thr308）(p＜0.001

23、)、p-Bad(p＜0.001)、p-GSK3β(p＜0.01)表達(dá)降低，而PTEN、p-PTEN、PI3K、Akt、Bad、GSK3β表達(dá)無(wú)明顯變化(p＞0.05); DMSO預(yù)處理GES-11h后PTEN、p-PTEN、PI3K、Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、Bad、p-Bad、GSK3β、p-GSK3β表達(dá)則均無(wú)明顯變化(p＞0.05)。
　　對(duì)照組、DMSO組、LY294002組中Hp作用

24、亞組均以Hp活菌按MOI=50作用1h后，各組間PTEN、PI3K、Akt、Bad、GSK3β表達(dá)均無(wú)明顯變化(p＞0.05)。對(duì)照組、DMSO組、LY294002組中Hp作用亞組p-PTEN(p＜0.05、p＜0.001、p＜0.01)、p-Akt(Ser473)(p＜0.001、p＜0.01、p＜0.01)、p-Akt(Thr308)(p＜0.001、p＜0.01、p＜0.01)、p-Bad(p＜0.05、p＜0.05、p＜0.01

25、)、p-GSK3β(p＜0.05、p＜0.05、p＜0.05)表達(dá)水平均顯著高于各自組中Hp未作用亞組。
　　6.Akt在Hp活菌激活胃黏膜上皮細(xì)胞株P(guān)TEN/PI3K/Akt信號(hào)通路中的作用
　　Akt i(Ⅷ)以10μM預(yù)處理GES-11h后，p-Akt(Ser473)(p＜0.001)、p-Akt(Thr308)(p＜0.001)、p-Bad(p＜0.001)、p-GSK3β(p＜0.01)表達(dá)降低，而PTEN、p-P

26、TEN、PI3K、Akt、Bad、GSK3β表達(dá)無(wú)明顯變化(p＞0.05); DMSO預(yù)處理GES-11h后PTEN、p-PTEN、PI3K、Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、Bad、p-Bad、GSK3β、p-GSK3β表達(dá)則均無(wú)明顯變化(p＞0.05)。
　　對(duì)照組、DMSO組、Akt i(Ⅷ)組中Hp作用亞組均以Hp活菌按MOI=50作用1h后，各組間PTEN、PI3K、Akt、Bad、GSK3

27、β表達(dá)均無(wú)明顯變化(p＞0.05)。對(duì)照組、DMSO組中Hp作用亞組p-PTEN(p＜0.01、p＜0.01)、p-Akt(Ser473)(p＜0.05、p＜0.01)、p-Akt(Thr308)(p＜0.05、p＜0.01)、p-Bad(p＜0.05、p＜0.05)、p-GSK3β(p＜0.01、p＜0.05)表達(dá)水平均顯著高于各自組中的Hp未作用亞組;Akt i(Ⅷ)組中Hp作用亞組p-PTEN表達(dá)水平顯著高于組中Hp未作用亞組(p

28、＜0.01)，而p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、p-Bad、p-GSK3β表達(dá)水平則與組中Hp未作用亞組無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　7.PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路在Hp活菌影響胃黏膜上皮細(xì)胞株生長(zhǎng)中的作用
　　(1) Hp活菌以不同濃度作用GES-1不同時(shí)間后MTT顯示，Hp活菌按MOI=5、10作用12h內(nèi)，GES-1細(xì)胞存活率均無(wú)明顯變化(p＞0.05);而按MOI=50、100作用

29、6h后，GES-1細(xì)胞存活率均開(kāi)始升高，12h達(dá)高峰(p＜0.001)，作用6、12h細(xì)胞存活率顯著高于0.5、1、3h(p＜0.001)，作用12h細(xì)胞存活率顯著高于6h(p＜0.001)。
　　(2) Hp活菌以MOI=50作用GES-1、GES-1-Empty、GES-1-PTEN-WT、GES-1-PTEN-MT不同時(shí)間后MTT顯示，在作用GES-1、GES-1-Empty、GES-1-PTEN-WT6h后，細(xì)胞存活率均開(kāi)

30、始升高，12h達(dá)高峰(p＜0.001)，作用6、12h細(xì)胞存活率顯著高于0.5、1、3h(p＜0.001)，作用12h細(xì)胞存活率顯著高于6h(p＜0.01);而在作用GES-1-PTEN-MT12h內(nèi)，細(xì)胞存活率則無(wú)明顯變化(p＞0.05)。
　　(3) Hp活菌以MOI=50作用DSMO、Akt i(Ⅷ)預(yù)處理的GES-1不同時(shí)間后MTT顯示，在作用無(wú)預(yù)處理、DSMO預(yù)處理的GES-16h后，細(xì)胞存活率均開(kāi)始升高，12h達(dá)高峰(

31、p＜0.001)，作用6、12h細(xì)胞存活率顯著高于0.5、1、3h(p＜0.001)，作用12h細(xì)胞存活率顯著高于6h(p＜0.01);而在作用Akt i(Ⅷ)預(yù)處理的GES-112h內(nèi)，細(xì)胞存活率則無(wú)明顯變化(p＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.PTEN表達(dá)下降和磷酸化失活參與了胃黏膜癌變過(guò)程，PTEN磷酸化失活是胃癌中PTEN失活的一種新機(jī)制。
　　2.Hp感染早期即可誘導(dǎo)PTEN磷酸化失活，進(jìn)而激活PI3K/A