幽門螺桿菌cag致病島cagI基因功能的研究.pdf

1、幽門螺桿菌(H.pylori)是人類常見的致病菌之一,是一種可長(zhǎng)期定植于人類胃粘膜的革蘭氏陰性螺旋形微需氧菌,在全世界范圍內(nèi)感染率超過50％。已證實(shí),H.pylori感染是慢性胃炎、消化性潰瘍發(fā)生的主要病因,并與胃癌、胃粘膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)；其重要毒力因子細(xì)胞毒素相關(guān)基因A蛋白(CagA)是經(jīng)cag致病島編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)注入到宿主細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮毒性作用。目前,cag致病島編碼基因的功能及其致病機(jī)理尚未完全明

2、確。因此,本文以cag致病島中的cagI基因?yàn)檠芯繉?duì)象,通過分子生物學(xué)、免疫學(xué)及微生物學(xué)等技術(shù)探討cagI基因的功能,旨為深入研究cag致病島的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.根據(jù)GenBank收錄的H.pylori26695全基因序列,利用生物信息學(xué)軟件Primer5.0自行設(shè)計(jì)cagI基因引物,獲得cagl基因,T-A克隆后構(gòu)建pMD18-T-cagI載體,測(cè)定序列；應(yīng)用DNA Star、Clustal1

3、.8及Merga4.0對(duì)其核苷酸及蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析研究,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
　　 2.構(gòu)建pET-28a-cagI原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE電泳和Western Blot方法鑒定表達(dá)CagI蛋白,并以Ni2+-NTA柱分離純化目的蛋白；純化后的CagI融合蛋白免疫家兔,制備抗CagI多克隆抗體,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清抗體效價(jià)。
　　 3.

4、收集H.pylori,重懸并裂解菌體,經(jīng)高速離心分離得到各菌體組分蛋白,包括周質(zhì)間隙蛋白、胞質(zhì)蛋白及膜蛋白(包括內(nèi)膜和外膜),利用Western Blot法檢測(cè)CagI蛋白的亞細(xì)胞定位。
　　 4.收集H.pylori感染的GES-1細(xì)胞,重懸裂解,并分離細(xì)胞組分,WesternBlot法檢測(cè)CagI蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 5.將上述方法分離的H.pylori細(xì)菌膜組分與CagI多抗及Protein G瓊脂糖珠子相孵育做免疫

5、共沉淀并用Western Blot法檢測(cè)互作蛋白及Cagl蛋白的存在,將His-CagI大腸桿菌細(xì)胞總蛋白裂解產(chǎn)物與上述H.pylori亞細(xì)胞分離膜組分混合,加入到鎳柱珠子中做Pull-down實(shí)驗(yàn),分析與CagI互作的蛋白,MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定互作蛋白。
　　 6.參考cagl基因測(cè)序結(jié)果,PCR擴(kuò)增cagI基因編碼區(qū)兩側(cè)翼序列,作為同源臂片段,構(gòu)建出帶卡那霉素抗性標(biāo)志的打靶載體pBluescript／ΔcagI∷KMr

6、,采用電穿孔法將載體pBluescript／ΔcagI∷KMr轉(zhuǎn)化入受體菌株NCTC11637中,并經(jīng)PCR驗(yàn)證后獲得了cagI基因缺失株,同理構(gòu)建出cagL基因缺失株(陽(yáng)性對(duì)照)。
　　 7.cagI基因的缺失株與野生株分別與胃上皮細(xì)胞GES-1進(jìn)行共培養(yǎng)后,檢測(cè)其對(duì)CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)及其對(duì)細(xì)菌粘附作用的影響。
　　 8.應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.0分析數(shù)據(jù),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組之間的比較采用t檢驗(yàn)。
　　

7、結(jié)果:
　　 1.擴(kuò)增獲得的cagI基因全長(zhǎng)1086bp,編碼361個(gè)氨基酸,獲得GenBank登錄號(hào)為HM126476。其核苷酸序列與兩株國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株(H.pylori26695及J99)同源性分別為98.3％和98.1％,其氨基酸序列與H.pylori26695同源性高達(dá)99.5％,基于核苷酸及氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹也說明了其同源性。DNA Star軟件預(yù)測(cè)其編碼蛋白相對(duì)分子量為39.37kDa；
　　 2.構(gòu)建獲得

8、了原核表達(dá)載體pET-28a-cagI,IPTG誘導(dǎo)后,經(jīng)SDS-PAGE鑒定和Western Blot鑒定有目的蛋白表達(dá)；采用Ni2+-NTA柱梯度洗脫后,分離獲得了目的蛋白CagI；CagI融合蛋白免疫家兔,獲得了抗Cagl多克隆抗體,其效價(jià)為1:1.6×105:
　　 3.Western Blot結(jié)果顯示CagI蛋白定位于菌體膜(包括內(nèi)膜和外膜)上；CagI蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CagI蛋白沒有轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞內(nèi),而陽(yáng)性對(duì)照C

9、agA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到了宿主細(xì)胞內(nèi)；免疫共沉淀、Pull-down及MALDI-TOF質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CagI蛋白與CagA蛋白有相互作用；
　　 4.PCR法擴(kuò)增得到用于同源重組的cagI基因的同源臂片段F1(612 bp)和F2(796 bp),同時(shí)得到了cagL基因的同源臂片段F1’(651 bp)和F2’(666 bp),并分別與pBluescript SKⅡ(-)載體(帶卡那霉素抗性基因的載體)相連接,構(gòu)建出pBluescr

10、ipt／ΔcagI∷KMr和pBluescript／ΔcagL∷KMr載體；采用電穿孔技術(shù)將載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入野生株NCTC11637菌體內(nèi),在含卡那霉素的哥倫比亞平板上篩出cagI基因及cagL基因的突變株,并用PCR方法及測(cè)序鑒定突變株；
　　 5.缺失株及野生株分別與胃上皮細(xì)胞GES-1共培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)cagI基因缺失株處理組,CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)明顯降低,而cagL基因缺失株處理組,胃上皮細(xì)胞內(nèi)未能檢測(cè)到CagA的轉(zhuǎn)運(yùn)；菌落形成實(shí)驗(yàn)

11、表明cagI基因缺失后細(xì)菌的粘附功能下降。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功克隆cagI基因,明確該基因是H.pylori cag致病島編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)基因之一,經(jīng)生物信息學(xué)分析其核苷酸序列及氨基酸序列相對(duì)保守。
　　 2.構(gòu)建了cagI基因的原核表達(dá)載體pET-28a-cagI,獲得并純化了在大腸桿菌中異源表達(dá)的重組CagI蛋白,制備了抗CagI的多克隆抗體。
　　 3.明確了CagI蛋白為一種膜相關(guān)