幽門(mén)螺桿菌cag-PAI基因cagX功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:構(gòu)建幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)cag PAI中基因cagX缺失株,探討該基因?qū)agY、cagW、cagN基因表達(dá)的影響、在CagA轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的作用及對(duì)細(xì)胞GES-1 IL-8 mRNA表達(dá)能力的影響；提取并純化CagX重組蛋白,免疫BALB／c小鼠,制備多克隆抗體,明確CagX的亞細(xì)胞定位及與尿素酶、過(guò)氧化氫酶等的關(guān)系。為深入探討幽門(mén)螺桿菌的致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:

2、
　　 1.根據(jù)GenBank中收錄的H.pylori26695全基因組序列,設(shè)計(jì)擴(kuò)增cagX基因缺失株的同源臂引物,用PCR方法從H.pylori NCTC11637基因組DNA中擴(kuò)增cagX基因同源臂片段,將克隆片段連至pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,再將片段定向插入含卡那抗性pBlueKM40載體中,經(jīng)酶切鑒定分析,將自殺質(zhì)粒命名為pBlueKM40-△cagX；
　　 2.構(gòu)建好的自殺質(zhì)粒與H.pylo

3、ri11637轉(zhuǎn)入電擊杯,利用同源重組原理,構(gòu)建cagX基因缺失株,自殺質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入幽門(mén)螺桿菌,通過(guò)抗生素平板進(jìn)行傳代篩選,通過(guò)PCR方法驗(yàn)證cagX基因缺失株H.pylori11637△cagX的獲得,提取cagX基因缺失前后細(xì)菌總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板PCR檢測(cè)基因cagY,cagW,cagN的表達(dá)；
　　 3.將cagX基因缺失株和野生株與正常胃上皮細(xì)胞GES-1進(jìn)行共培養(yǎng),然后采用Western

4、blot的方法檢測(cè)H.pylori轉(zhuǎn)運(yùn)CagA蛋白的能力,提取細(xì)胞總RNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-8 mRNA的表達(dá)；
　　 4.將原核表達(dá)的CagX蛋白用Ni2+-NTA柱進(jìn)行分離純化,純化的蛋白CagX與弗氏佐劑充分乳化后,免疫BALB／c小鼠,制備多克隆抗體,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清中抗體效價(jià)；
　　 5.收集H.pylor

5、i,重懸并裂解菌體,收集細(xì)菌總蛋白,經(jīng)超高速離心分離得到菌體各組分蛋白,包括周質(zhì)間隙蛋白、胞質(zhì)蛋白及內(nèi)外膜蛋白,利用Western Blot法檢測(cè)CagX蛋白的亞細(xì)胞定位；細(xì)菌總蛋白再與protein A／G plus agarose珠子混合,利用CagX抗體分離出相關(guān)蛋白,SDS-PAGE分析與CagX相關(guān)的蛋白；
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)過(guò)PCR及與載體連接,成功構(gòu)建了幽門(mén)螺桿菌cagX基因的自殺質(zhì)粒pBlueKM

6、40-△cagX,經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化抗生素篩選獲得了cagX基因的缺失株。
　　 2.提取H.pylori野生株及cagX基因缺失株總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,并以其為模板檢測(cè)cagX上下游基因cagW、cagT及伴侶蛋白cagN基因表達(dá)變化,結(jié)果顯示cagX基因缺失后,上下游基因表達(dá)量均受到影響,而cagN基因表達(dá)并沒(méi)有變化。
　　 3.將野生株與cagX基因缺失株分別與正常胃上皮細(xì)胞GES-1共培養(yǎng)后,Westernblot

7、檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),cagX基因缺失株處理組中未檢測(cè)到的CagA的轉(zhuǎn)運(yùn),而野生株中CagA轉(zhuǎn)運(yùn)成功。
　　 4.野生株與cagX基因缺失株分別與正常胃上皮細(xì)胞GES-1共培養(yǎng)后,提取細(xì)胞的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子IL-8mRNA的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)cagX基因缺失后IL-8mRNA表達(dá)受到影響；
　　 5.cagX-pET32a原核表達(dá)重組質(zhì)粒,在濃度1mmol／L IPTG,溫度30℃,誘導(dǎo)時(shí)間4h條

8、件下誘導(dǎo),利用Ni2+-NTA柱進(jìn)行分離純化；純化的CagX蛋白免疫BALR／c小鼠,獲得CagX融合蛋白多克隆抗體,效價(jià)為1:3.2×105；Western Blot結(jié)果顯示CagX蛋白定位于菌體內(nèi)外膜；免疫共沉淀及質(zhì)譜結(jié)果發(fā)現(xiàn),CagX與尿素酶、過(guò)氧化氫酶等有關(guān)。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了cagX基因自殺質(zhì)粒及缺失株,與野生株比較,cagX的缺失影響其上下游基因cagY.cagW的表達(dá),但對(duì)cagN的表達(dá)沒(méi)有影響；在與正常胃上