幽門螺桿菌Cag致病島中hp0523基因功能的鑒定與分析.pdf

1、目的：幽門螺桿菌的細(xì)胞毒性蛋白A(CagA)是一個(gè)重要的毒力因子，與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。其是通過Cag致病島(Cag—PAI)編碼的Ⅳ型樣分泌裝置，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入胃上皮細(xì)胞，發(fā)揮毒性作用。而Cag—PAI中編碼的基因功能及其致病機(jī)理均尚未十分明確。研究Cag—PAI中編碼的hp0523基因的功能，并探討其在CagA轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用，為深入研究Cag—PAI的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 方法：①利用PCR技術(shù)從H．pylori基因組DNA中擴(kuò)增

2、獲取hp0523基因，T—A克隆后構(gòu)建pGEM—T—hp0523，進(jìn)行序列測(cè)定；并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析研究；②構(gòu)建pET-28a—hp0523原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)；經(jīng)IFFG誘導(dǎo)后，SDS—PAGE法和Western blot法鑒定表達(dá)后，并以Ni2+—NTA柱分離純化目的蛋白；進(jìn)一步對(duì)純化蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性研究；③擴(kuò)增獲得hp0523基因上下游同源臂片段F1、F2，構(gòu)建自殺質(zhì)粒pBlueKM40/Δhp

3、0523：Kmr，電擊轉(zhuǎn)化H．pylori后經(jīng)抗生素篩選hp0523基因缺失株，再進(jìn)行PCR鑒定；④采用hp0523基因缺失株和野生株與胃癌上皮細(xì)胞BGC-823進(jìn)行共培養(yǎng)，而后采用Western blot法檢測(cè)CagA蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)能力變化。 結(jié)果：⑴擴(kuò)增獲得的hp0523基因全長(zhǎng)為510bp，編碼169aa，與GenBank公布的26695、J99同源性為92～95％：蛋白相對(duì)分子量Mr預(yù)測(cè)為19.7 kDa，等電點(diǎn)pI為9.53

4、；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，在33～165位aa之間存在一個(gè)保守的SLT催化基序，第56位谷氨酸(GLU56)是催化活性的中心位點(diǎn)，C端序列上含有一個(gè)肽聚糖結(jié)合域“AVGAY”，故預(yù)測(cè)hp0523基因可能是一個(gè)肽聚糖水解酶編碼基因；⑵構(gòu)建獲得了原核表達(dá)載體pET-28a—hp0523，IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS—PAGE鑒定和Western blot鑒定有目的蛋白表達(dá)；采用Ni2+—NTA柱梯度洗脫后，分離獲得了目的蛋白HP0523；⑶HP052

5、3經(jīng)復(fù)性處理后，采用溶菌斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有溶菌活力：而后采用SDS煮沸法分離提取獲得細(xì)菌肽聚糖，進(jìn)行凝膠酶譜分析后，發(fā)現(xiàn)HP0523蛋白具有肽聚糖水解能力；理化特性研究表明，HP0523具有廣譜的溶菌能力，但酶活力較溶菌酶低；其最適酶活力pH值為6.0；⑷連接F1、F2后構(gòu)建自殺質(zhì)粒pBlueKM40/Δhp0523：：Kmr，電擊轉(zhuǎn)化后經(jīng)抗生素篩選，并經(jīng)PCR驗(yàn)證后獲得了hp0523基因缺失株；缺失株、野生株分別與胃癌上皮細(xì)胞BGC-