幽門螺桿菌基因hp0410的克隆表達(dá)及HP0410的免疫原性研究.pdf

1、一、本研究的主要目的是：①通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)hp0231和hp0410編碼蛋白的性質(zhì)特征和免疫原性；②在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中克隆表達(dá)hp0410，并純化獲得重組蛋白；③用重組蛋白篩查胃潰瘍患者和健康人血清，檢測(cè)HP0410能否在體內(nèi)誘導(dǎo)出特異性抗體，并進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，探討該蛋白是否可作為一種新的檢測(cè)Hp感染的方法；④建立噬菌體肽展示文庫，對(duì)HP0410的抗原表位進(jìn)行研究；⑤建立細(xì)胞模型，初步探討HP0410與胃上皮細(xì)胞的相互作

2、用。通過以上研究，為構(gòu)建多嵌合表位重組疫苗，或以嗜酸乳桿菌為載體的活疫苗的研制提供理論依據(jù)和工作基礎(chǔ)。 二、研究方法 1、提取幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11639的基因組DNA，按照GenBank中幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)株22695的序列設(shè)計(jì)引物PCR，擴(kuò)增hp0231和hp0410基因，克隆入pMD18-T載體中測(cè)序，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。 2、hp0231和hp0410克隆入表達(dá)載體pGEX-4T-1中，誘導(dǎo)表達(dá)，SDS

3、-PAGE電泳鑒定。大量表達(dá)HP0410，GST柱純化重組蛋白。 3、利用純化HP0410從29株小鼠抗幽門螺桿菌單抗中篩選出抗HP0410單抗，特異性一敏感性實(shí)驗(yàn)及免疫組化鑒定，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附(E12SA)實(shí)驗(yàn)，篩查85份胃潰瘍患者血清和90份健康人血清，分析ELISA結(jié)果。 4、篩選出抗HP0410單抗E018，利用該單抗和M13噬菌體12肽隨機(jī)肽庫，構(gòu)建HP0410抗原表位的抗原展示庫，陽性噬菌體測(cè)序，分析HP0

4、410的抗原表位。 5、建立HP0410和細(xì)胞相互作用的模型，通過測(cè)定不同濃度、不同時(shí)間HP0410作用下SGC7901細(xì)胞IL-8和GRO-a分泌量的變化，以及細(xì)胞ELISA探討HP0410和SGC7901細(xì)胞的相互作用。 三、研究結(jié)果 1、生物信息學(xué)分析表明，HP0231和HP0410均為外膜蛋白，有跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽序列，具有良好的抗原性。hp0231和hp0401在Hp中普遍存在，BLAST分析表明這2個(gè)

5、蛋白有很高的種屬特異性，為Hp所特有。 2、構(gòu)建重組菌株，高水平表達(dá)可溶性重組蛋白HP0410。利用純化的重組HP0410蛋白篩查29株單抗，獲得高特異性單抗一株(E018)。 3、HP0410篩查85份胃潰瘍患者血清，陽性94.1％，結(jié)果表明抗HP0410抗體在患者血清中普遍存在；篩查90份正常人血清，陽性74.4％，陽性檢出率與我國(guó)Hp感染率接近，表明Hp攜帶者體內(nèi)也存在抗HP0410抗體；免疫組化實(shí)驗(yàn)表明利用抗HP

6、0410單抗檢測(cè)HP0410，可作為一個(gè)有效的檢測(cè)Hp感染的方法。 4、分析噬菌體測(cè)序結(jié)果獲得HP0410的模擬空間表位，其中1個(gè)為模擬HP0410與E018特異性結(jié)合的抗原決定簇的候選表位。展示的抗原表位在HP0410上的分布符合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，且多處于的β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)中，這些表位的HP0410同源區(qū)與預(yù)測(cè)的HLAⅡ類分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域一致。 5、HP0410不能顯著性的上調(diào)胃腺癌細(xì)胞SGC7901表達(dá)IL-8，也不能刺激

7、細(xì)胞產(chǎn)生GRO-a，提示HP0410并非HP的炎性因子，符合其主要功能為介導(dǎo)黏附的預(yù)測(cè)；細(xì)胞ELISA結(jié)果呈陰性，提示E018針對(duì)的抗原決定簇即為HP0410的黏附結(jié)構(gòu)域亦可能HP0410不能直接與SGC7901細(xì)胞結(jié)合。 四、結(jié)論 1、生物信息學(xué)分析表明HP0410有良好的抗原性，可以誘導(dǎo)出特異性的體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，提示HP0410可作為Hp的候選疫苗。 2、免疫組化實(shí)驗(yàn)表明檢測(cè)HP0410可成為檢測(cè)np感染的