hp1188基因的克隆表達(dá)及免疫特性研究.pdf

1、目的：選擇暴露于細(xì)菌表面并與幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，H.pylori）定植密切相關(guān)的黏附素Hp1188為目標(biāo)，通過基因工程技術(shù)獲得純化的重組黏附素蛋白Hp1188（recombinantHp1188protein，rHp1188），在體外和小鼠模型中評(píng)價(jià)其免疫特性及對(duì)H.pylori感染的免疫保護(hù)效果，以確定rHp1188在H.pylori疫苗研制中的應(yīng)用價(jià)值。 方法： ①構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30

2、-hp1188，DNA測(cè)序分析正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。Ni2+-NTA樹脂純化表達(dá)蛋白，SDS-PAGE分析其純度，Bradford法測(cè)定其濃度，Westernblot分析其抗原特異性，雙向免疫擴(kuò)散檢測(cè)其效價(jià)。 ②以純化的rHp1188為抗原，建立檢測(cè)血清HpyloriHp1188抗體的間接ELISA法，與科研診斷標(biāo)準(zhǔn)比較評(píng)價(jià)其應(yīng)用價(jià)值。 ③建立H.pylori感染小鼠模型，在該模型中評(píng)價(jià)rHp1

3、188與黏膜佐劑霍亂毒素B亞單位（choleratoxinsubunitB，CTB）結(jié)合預(yù)防H.pylori感染的效果：ELISA法檢測(cè)血清和小腸黏液中抗Hp1188抗體產(chǎn)生情況；胃組織H.pylori培養(yǎng)和組織切片Giemsa染色觀察細(xì)菌定植量的改變；HE染色檢查免疫后小鼠胃黏膜的病理學(xué)改變。 結(jié)果： ①成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQE30-hp1188，序列分析顯示hp1188結(jié)構(gòu)基因由810bp組成，與基因文庫(kù)中的hp11

4、88基因同源性達(dá)98％，開放讀碼框完整無中斷，編碼269個(gè)氨基酸。SDS-PAGE顯示表達(dá)產(chǎn)物相對(duì)分子量約30kD，可溶性表達(dá)占全菌蛋白的47％以上，純化后獲得純度達(dá)90％的rHp1188，濃度為1.0mg/ml。兔抗rHp1188血清雙向免疫擴(kuò)散檢測(cè)抗體效價(jià)為1：16；Westernbolt結(jié)果顯示該蛋白可被兔抗H.pylori全菌抗體識(shí)別，在30kD附近出現(xiàn)反應(yīng)條帶。 ②對(duì)臨床血清標(biāo)本的ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，Hp1188抗

5、體檢測(cè)的敏感性和特異性分別為87.5％和86.7％。 ⑧預(yù)防組小鼠在血清和腸黏液中檢測(cè)到高水平抗體（IgG、IgA）；胃組織H.pylori培養(yǎng)陽(yáng)性率、H.pylori定植及炎癥程度均明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組（P<0.05）。預(yù)防組不僅可以減少H.pylori的定植，而且能減輕H.pylori造成的胃組織的局部炎癥反應(yīng)。 結(jié)論： 成功構(gòu)建了基因工程菌pQE30-hp1188-DH5α，并高效表達(dá)了rHp1188，表達(dá)蛋