油桐KASⅡ基因的克隆及表達(dá)研究.pdf

1、油桐是我國原產(chǎn)的古老樹種，與油茶、烏桕、核桃并稱為我國的四大木本油料作物，是具有代表性的經(jīng)濟(jì)林樹種，有重要的經(jīng)濟(jì)價值。油桐通過植物脂類的生物合成途徑將合成的油脂貯存于種子中。KAS全稱β-酮脂酰-ACP合酶，主要有3類，KASⅠ、KASⅡ、KASⅢ,在植物油脂的生物合成途徑中， KAS基因家族起到關(guān)鍵性的作用，他們啟動脂肪酸合成、參與決定脂肪酸的碳鏈結(jié)構(gòu)，是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶。KASⅡ在此過程中，具有增長碳鏈，決定C16增長為C18的功

2、能，該過程不可逆，也是脂肪酸合成過程中的限速步驟。本研究對油桐KASⅡ基因進(jìn)行克隆和表達(dá)的研究，對探索油桐脂肪合成的分子機(jī)制具有重要意義。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1、油桐KASⅡ基因的cDNA全長克隆，擴(kuò)增得到903bp的序列，設(shè)計3'RACE及5'RACE引物進(jìn)行RACE擴(kuò)增，分別獲得1124和1086bp的序列，得到完整的2064bp的cDNA序列。利用ORF Finder查找其編碼區(qū)，得到1701bp的CDS序列并對其進(jìn)

3、行結(jié)構(gòu)預(yù)測，得到該蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)。分析該蛋白質(zhì)序列，獲得其基本理化性質(zhì)及其在細(xì)胞中的分布情況。
　　2、油桐基因組提取與Sourthern blot檢測。提取油桐種子基因組，根據(jù)已知的KASⅡ基因序列設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳回收后單酶切該片段，得到帶有酶切位點(diǎn)的目的片段。將該片段轉(zhuǎn)膜固定后與探針雜交、免疫檢測，結(jié)果表面KASⅡ基因在油桐種子基因組中至少有兩個拷貝。
　　3、油桐KASⅡ基因CDS序列克隆

4、及原核表達(dá)。利用PCR擴(kuò)增得到的CDS片段，連接pMD18克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得CDs的克隆。根據(jù)已獲得的油桐KASⅡ基因CDS序列，設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增重組克隆質(zhì)粒。得到大量重組質(zhì)粒后進(jìn)行酶切，回收目的片段并將其與酶切后的表達(dá)載體pGEX-4t-1連接，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株Rosseta。獲得大量表達(dá)載體后通過涂平板、PCR、酶切驗(yàn)證其陽性。對正確轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)成功后得到大小約為75KDa的特異

5、條帶，其誘導(dǎo)表達(dá)的合適條件為:18℃、220rpm、IPTG濃度為0.5mM誘導(dǎo)4小時。
　　4、油桐KASⅡ蛋白的分析及純化。誘導(dǎo)得到KASⅡ基因的表達(dá)蛋白后，破碎菌體細(xì)胞，得到細(xì)胞懸液，對上清液和蛋白沉淀分別進(jìn)行PAGE電泳，分析蛋白的可溶性。結(jié)果表明該蛋白在沉淀中有特異條帶，即其表達(dá)形式為包涵體沉淀。對沉淀進(jìn)行洗滌，除去其表面糖類、線粒體DNA、其他表達(dá)蛋白等雜質(zhì)后獲得純凈的表達(dá)蛋白。
　　通過本研究，獲得了油桐KAS