油桐KASⅡ基因的克隆及表達研究.pdf

1、油桐是我國原產的古老樹種，與油茶、烏桕、核桃并稱為我國的四大木本油料作物，是具有代表性的經濟林樹種，有重要的經濟價值。油桐通過植物脂類的生物合成途徑將合成的油脂貯存于種子中。KAS全稱β-酮脂酰-ACP合酶，主要有3類，KASⅠ、KASⅡ、KASⅢ,在植物油脂的生物合成途徑中， KAS基因家族起到關鍵性的作用，他們啟動脂肪酸合成、參與決定脂肪酸的碳鏈結構，是脂肪酸合成的關鍵酶。KASⅡ在此過程中，具有增長碳鏈，決定C16增長為C18的功

2、能，該過程不可逆，也是脂肪酸合成過程中的限速步驟。本研究對油桐KASⅡ基因進行克隆和表達的研究，對探索油桐脂肪合成的分子機制具有重要意義。本研究的主要結果如下:
　　1、油桐KASⅡ基因的cDNA全長克隆，擴增得到903bp的序列，設計3'RACE及5'RACE引物進行RACE擴增，分別獲得1124和1086bp的序列，得到完整的2064bp的cDNA序列。利用ORF Finder查找其編碼區(qū)，得到1701bp的CDS序列并對其進

3、行結構預測，得到該蛋白序列的二級結構。分析該蛋白質序列，獲得其基本理化性質及其在細胞中的分布情況。
　　2、油桐基因組提取與Sourthern blot檢測。提取油桐種子基因組，根據已知的KASⅡ基因序列設計帶有酶切位點的引物進行PCR擴增。電泳回收后單酶切該片段，得到帶有酶切位點的目的片段。將該片段轉膜固定后與探針雜交、免疫檢測，結果表面KASⅡ基因在油桐種子基因組中至少有兩個拷貝。
　　3、油桐KASⅡ基因CDS序列克隆

4、及原核表達。利用PCR擴增得到的CDS片段，連接pMD18克隆載體，轉化大腸桿菌DH5α，獲得CDs的克隆。根據已獲得的油桐KASⅡ基因CDS序列，設計帶有酶切位點的引物，擴增重組克隆質粒。得到大量重組質粒后進行酶切，回收目的片段并將其與酶切后的表達載體pGEX-4t-1連接，轉化表達菌株Rosseta。獲得大量表達載體后通過涂平板、PCR、酶切驗證其陽性。對正確轉化的表達菌株進行IPTG誘導表達，誘導成功后得到大小約為75KDa的特異

5、條帶，其誘導表達的合適條件為:18℃、220rpm、IPTG濃度為0.5mM誘導4小時。
　　4、油桐KASⅡ蛋白的分析及純化。誘導得到KASⅡ基因的表達蛋白后，破碎菌體細胞，得到細胞懸液，對上清液和蛋白沉淀分別進行PAGE電泳，分析蛋白的可溶性。結果表明該蛋白在沉淀中有特異條帶，即其表達形式為包涵體沉淀。對沉淀進行洗滌，除去其表面糖類、線粒體DNA、其他表達蛋白等雜質后獲得純凈的表達蛋白。
　　通過本研究，獲得了油桐KAS