苧麻GalAT、UGlcAE基因克隆及組織表達(dá)研究.pdf

1、苧麻韌皮纖維是一種具有中國特色的優(yōu)良植物紡織材料，然而脫膠過程出現(xiàn)了許多問題和不足：如降低麻纖維強(qiáng)度、精干麻制成率較低、纖維可紡性能劣化、工藝流程長、脫膠成本高、煮煉廢液含堿較多、環(huán)境污染嚴(yán)重、能源消耗大等，嚴(yán)重制約了麻紡工業(yè)的發(fā)展。果膠是苧麻韌皮部主要的膠質(zhì)成分之一，在膠質(zhì)成分中僅次于半纖維素，它將各種膠質(zhì)組分粘在一起使得其它膠類物質(zhì)難以脫除，去除果膠是苧麻脫膠的主要目標(biāo)之一。適度降低果膠的含量是當(dāng)前苧麻品質(zhì)育種的一個(gè)重要方向。Gal

2、AT(a－1，4-Galacturonosyltransferase)和UGlcAE(UDP-glucuronicacid4-epimerase)分別是果膠及果膠主要組分生物合成的關(guān)鍵酶。因而對GalAT和UGlcAE的基因序列及組織表達(dá)特征進(jìn)行研究，為后期從分子水平上調(diào)控苧麻果膠含量的研究奠定基礎(chǔ)具有較大的實(shí)際價(jià)值。 本研究采用SMART技術(shù)構(gòu)建苧麻韌皮部全長cDNA文庫；用簡并引物RT-PCR法克隆目標(biāo)基因cDNA核心序列；

3、用RACE技術(shù)和全長cDNA文庫篩選法獲得全長cDNA序列；用生物信息學(xué)方法對獲得的cDNA序列及推定氨基酸序列進(jìn)行分析；用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法對目標(biāo)基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行研究。 主要研究結(jié)果如下： (1)構(gòu)建了苧麻優(yōu)良品種：中苧一號的韌皮部全長cDNA文庫，原始文庫滴度為1.25×105pfu/mL，重組率為92％，擴(kuò)增文庫滴度為1.13x109pfu/mL。為克隆苧麻優(yōu)良基因全長序列，并研究其遺傳規(guī)律打下了基礎(chǔ)。

4、 (2)克隆了GalAT基因的三個(gè)cDNA片段，序列長度分別為1087bp、986bp和238bp。將986bp序列登錄Genbank，獲得登錄號為：EU131377。該序列編碼328個(gè)連續(xù)氨基酸序列，用NCBI進(jìn)行在線保守區(qū)分析，結(jié)果表明包含一個(gè)保守區(qū)：Glycosyl-transferasefamily8；BlastN分析發(fā)現(xiàn)與擬南芥的GAUT4(擬南芥Galacturonosyltransferase家族基因之一)的同源性

5、最高，為77％；BlastP分析發(fā)現(xiàn)與擬南芥的GAUT4同源性最高，為83％；多序列比對分析表明苧麻GalAT基因與擬南芥Galacturonosyltransferase基因家族的基因有一定程度的保守性；分子進(jìn)化分析表明：苧麻GalAT基因的推定蛋白氨基酸序列與擬南芥的GAUT4聚為一類，它們之間的同源關(guān)系明顯大于擬南芥Galacturonosyltransferase家族其它基因。 (3)克隆了UGlcAE基因的三個(gè)cDNA

6、片段，序列長度分別為308bp、410bp和262bp。 (4)以已獲得的UGlcAE基因的410bpcDNA片段為基礎(chǔ)克隆了它的全長cDNA序列，序列長度為1257bp，開放讀碼框介于443bp和1165之間，編碼241個(gè)的氨基酸序列，Genbank登錄號為EU131378。經(jīng)預(yù)測蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI為9.86，相對分子質(zhì)量為26kD，InterPro分析發(fā)現(xiàn)存在NAD(P)結(jié)合位點(diǎn)、NAD-dependentepimerase

7、/dehydratase和UDP-galactose-4-epimerase結(jié)構(gòu)域，用NCBI編碼區(qū)序列進(jìn)行在線保守區(qū)分析，結(jié)果表明含有高保守區(qū)UDP-galactose-4-epimerase。Blastn分析發(fā)現(xiàn)與與玉米的同源性最高，為84％，BlastP分析發(fā)現(xiàn)與擬南芥的GAE6(擬南芥UGlcAE家族基因之一)同源性最高。多序列比對分析表明，苧麻UGlcAE基因推定氨基酸序列與其它物種相應(yīng)序列存在較高的的保守性，分子進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)

8、苧麻的UGlcAE基因推定的氨基酸序列與擬南芥UGlcAE家庭基因GAE6的同源性高于其它植物以及擬南芥的其它UGlcAE家族基因。 (5)研究了GalAT基因在苧麻中苧一號中各組織的表達(dá)分布情況，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)，GalAT基因在苧麻各個(gè)組織中都有表達(dá)，其中根部的GalAT基因表達(dá)量占優(yōu)，葉片次之，韌皮部和木質(zhì)部含量最少，并且兩者無顯著差別。 (6)研究了UGlcAE基因在苧麻中苧一號中各組織的表達(dá)分布情況，

9、通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)，UGlcAE基因在苧麻各個(gè)組織中都有表達(dá)，UGlcAE基因的mRNA量依次為根部>葉片>韌皮部>木質(zhì)部。 (7)比較了GalAT和UGlcAE基因在苧麻各組織表達(dá)情況的差異，兩基因在各組織中的表達(dá)情況基本一致，都表現(xiàn)為根部>葉片>韌皮部>或-木質(zhì)部，在本研究感興趣的韌皮部中，GalAT基因的表達(dá)量是UGlcAE基因的0.6533倍，提出在后期進(jìn)行苧麻果膠分子調(diào)控試驗(yàn)可優(yōu)先從GalAT基因入手或同時(shí)進(jìn)行