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1、該文中的試驗(yàn)魚——蒙古鮊購自南湖漁場,健康無病,雄魚體長23.1cm,體重151.3g;雌魚體長為25.2cm,體重155.6g。根據(jù)已知的人和鼠ob基因序列設(shè)計(jì)引物,引物中分別引入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn),通過RT-PCR從蒙古鮊脂肪組織RNA中擴(kuò)增到ob基因片段。將此片段與pBluescripSK(+)載體同時(shí)用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切,電泳回收各自片段后連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含IPTG、X-gal和
2、Amp+的瓊脂糖平板,挑取乳白色的菌落,進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定,陽性克隆命名為pSK-ob,將此質(zhì)粒送大連寶生物公司測序,首次獲得蒙古鮊ob基因編碼區(qū)438bp的序列。ob基因序列在不同物種之間具有很高的保守性。將此序列與人、鼠和豬的ob基因序列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)蒙古鮊與人、鼠和豬ob基因核苷酸編碼序列的同源性分別為82%、84%和99%;蒙古鮊ob基因編碼的蛋白leptin氨基酸序列與人、鼠和豬leptin蛋白氨基酸同源性分別為80.
3、8%、78.8%和95.2%。定量取蒙古鮊不同組織0.2g,提取其總RNA后,用半定量RT-PCR技術(shù)分析組織ob基因表達(dá)特異性,結(jié)果表明:ob基因在脂肪和肝臟組織中表達(dá)量最大,在心臟、脾臟、肌肉、腦、卵巢中表達(dá)量次之,在腎臟中表達(dá)很少,而在精巢和腸道組織中不表達(dá)。將含ob基因的克隆載體pSK-ob與表達(dá)載體pET-28a同時(shí)用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切,回收所需片段連接并轉(zhuǎn)化后,涂布于含IPTG、X-gal和Kan+的瓊脂糖平板,挑
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