gdnf基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

1、4 4S UZ H O UUN I VE R S I T YJ O U R N A LO FME D I C A LS C I E N C E2 0 0 4 ； 2 4 ( 1 )G D N F基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建 王運(yùn) 良，張志琳，包仕堯，石 向群 ( 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科， 江蘇蘇 州 2 1 5 0 0 4 )摘 要 ： 目的 克 隆大 鼠膠 質(zhì)細(xì) 胞 源 性 神 經(jīng) 營 養(yǎng) 因子 ( G D N F ) 全 長 基

2、 因 ， 構(gòu) 建 真 核 細(xì) 胞 表 達(dá) 質(zhì) 粒 。方 法 從 孕 1 7d 大 鼠胚胎 腦 組 織中提 取 R N A ， 參 照 分 子 克 隆 指 南 ， 合 成 c D N A 第 1 、 2鏈 ， 加 入 引 物 P C R 擴(kuò) 增 目的 基 因 。 與 p c D N A 3 質(zhì)粒連接， 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。結(jié)果 提取的總 R N A經(jīng)純化后 電泳出現(xiàn) 1 8S 和 2 8S 兩條帶 ， P C R擴(kuò)增的 目的 基 因 為 6 3

3、 0b p 大 小 的條帶 ， 測 序結(jié) 果 為 6 3 3b p 。結(jié) 論 正 確地 克隆 了大 鼠 G D N F基 因全 序列 ， 為進(jìn) 一步 獲 得 重組 活性的 G D N F蛋白和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)和臨床研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；基因序列 ；載體 ；克隆 中圖分類號 ： R 3 9 4 ． 8 ；Q 7 8 2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ： A 文章編號 ： 1 0 0 0 — 5 7 4 9 【 2 0 0 4

4、 ) 0 1 — 0 0 4 4 — 0 3Cl o n i n go fGDNFGe n ea n dCo n s t r u c t i o no fEx p r e s s i o nVe c t o rWANG Yun — l i a n g，Z HA N G Z hi — l i n，BAO S hi — y a o ， e ta l( D e p to fN e u r o l o g y ， t h eS e c o

5、 n dHo s p i t a lA f f i l i a t e dt oS u z h o uUn i v e r s i t y ，S u z h o u2 1 5 0 0 4 ， C h i n a )Ab s t r a c t ： Ob j e c t i v eToc l o n et h eg l i a lc e l ll i n e — d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf

6、a c t o rt o t a lg e n eo fr a ta n dc o n s t r u c te x p r e s s i o no fp r o k a r y o t i cc e l 1M e t h o d sTo t a lR NA wa se x t r a c t e df r o m f e t a lr a tb r a i no ft i me d — p r e g n a n tmo m

7、a tEl 7 ， a c c o r d i n gt ot h eg u i d eo fmo l e c u l a rc l o n e ， t h ef i r s ta n ds e c o n dc DNA c h a i n swe r es y n t h e s i z e da n dGDNF g e n ewa sa mp l i f i e db yP CR u s i n gp r i me r s ．T

8、h eDNA p r o d u c twa st h e nl i n k e dwi t hp c DNA3p l a s mi da n dt h ee x p r e s s i o nv e c t o rwa sb u i l t ． R e s u l t sP u r i f i e dRNAs h o w e dt w ob a n d si ne l e c t r o c h r o m a t o g r a

9、p h y( 18Sa n d2 8S ) ，G D NFg e n es h o w e da6 3 0b pb a n db yRT— PC R a mp l i f i c a t i o n ， a n dt h eDNA f r a g me n ts i z ewa s6 3 3b p．Co n c l u s i o nTh et o t a ls e q u e n c eo fGDNFg e n ei sc l o

10、 n e dc o r r e c t l yh a se s t a b l i s h e dt h ef u n d a t i o nf o ro b t a i n i n gt h ep r o t e i no fGDNFwi t hr e c o mb i n a t i o na c t i v i t ya n dt h eb a s i ca n dc l i n i c a lr e s e a r c hi n

11、n e r v o u ss y s t e m d i s e a s e s ．Ke ywo r d s ：g l i a lc e l ll i n e — d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r ；g e n es e q u e n c e ；v e c t o r ；c l o n e膠 質(zhì)細(xì)胞源性營 養(yǎng)因子 ( G D N F ) 屬 于 轉(zhuǎn)化生 長 因子 ( T

12、G F - 1 3 ) 超 家 族 的 一個 新 成 員。 早期 研 究表 明， G D N F對 中腦 多 巴胺能 神經(jīng) 元有 專 一的 營養(yǎng) 作 用。以后發(fā)現(xiàn) G D N F對 多種 細(xì)胞 都具 有營養(yǎng) 作 用，是一種 有重要 生物 活性 的營 養(yǎng) 因子 ， 對 參與 神經(jīng) 細(xì) 胞程 序化死亡 、 促進(jìn)神經(jīng)元存活 、 參與軸 突損傷的修 復(fù)及促進(jìn) P u k i n j e 細(xì)胞分 化和 發(fā)育方 面 有其 他生 長 因子不 可 比擬

13、 的作 用。但 G D N F由于 在 腦 組織 中含量 低 、 提取過 程復(fù)雜 、 價格昂貴而限制 了它在基礎(chǔ) 和 臨床研究中 的廣 泛作 用。為此 ， 我 們克 隆 了大 鼠的 G D NF基因， 連 于 p c D N A 3質(zhì) 粒 ， 制 備帶 有 目的 基 因的真核細(xì)胞表 達(dá) 質(zhì)粒， 為 進(jìn)一 步 的臨床 和基 礎(chǔ) 研究 奠定了基礎(chǔ) 。1 材料 和方法 1 ． 1 材料 孕 1 7d 大 鼠由蘇州大學(xué) 動物 實驗 中心 提供

14、?？?R N A提 取試劑盒 、 c D N A第 1 鏈 合成試劑 盒購 自上海 生物 工 程公 司。R N A 純化 試劑 盒 由南 京建成生物工 程公司提 供 。質(zhì)粒 p c D N A 3為復(fù) 旦大 學(xué)遺傳研究所提 供。菌種 E． c o l iD H5 a 為本科實驗 室保 存。 主 要 試 劑 和 工 具 酶 ： MML V 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 、T 4 D N A連接 酶 、 T 4 D N A 聚 合酶 、 T a qD N

15、 A 聚 合酶 及 d N T P s 均 由華 美 生 物 公 司 提 供 。核 酸 內(nèi)切 酶 B a mHI、 H i n dI I I為 P r o me g a 公司 產(chǎn)品。引物設(shè) 計 ： 參 考G e n e B a n k 和文 獻(xiàn) 報道 ， 自行設(shè) 計 上 、 下游 引物 ， 由上海生 物 工 程公 司 合成 。 上游 ：收 稿 日期 ： 2 0 0 3 一 O 6 — 2 O 作 者簡 介 ： 王運(yùn) 良( 1 9 6 4

16、 一) 。 男 。 浙 江金 華人 。 副主任 醫(yī)師 。 博士 后。 研 究方 向腦 血管病 的基礎(chǔ) 和臨 床 。 * 通訊 作者 維普資訊 http://www.cqvip.com 4 6S U Z H O UUN I V E R S I T YJ O U R N A L0FME DI C A LS C I E N C E2 0 0 4 ； 2 4 ( 1 )圖 3~D N A 3質(zhì)粒 酶切位 點 的生長 、 分 化和損 傷后 的修

17、復(fù)方 面被 認(rèn) 為是 最有 潛 力的營養(yǎng) 因子 【 3J 。不僅 對 中樞神 經(jīng) 系統(tǒng) ， 而 且對周 圍運(yùn)動 、 感 覺 和 自主 神 經(jīng) 系 統(tǒng)也 有 同樣 的 作 用【 4 ] 。對保護(hù)神 經(jīng)元 的抗 損傷 及 損傷 后神 經(jīng)元 的修復(fù) 、 再 生 、 營養(yǎng)支持等方 面有 其 他神 經(jīng)生 長因 子不 可替 代 的作 用【 5 ． 6J 。 由于 G D N F在 組織 中含 量極 少， 靠 生 物提取方法 無法 大量 獲 得。我

18、們根據(jù) 文 獻(xiàn)報道 ， 應(yīng) 用分子克 隆技 術(shù)從懷孕 S D大 鼠胚胎腦 組織 成功 地 克隆 了 G D N F基 因， 全長 為 6 3 3b p ， 2 1 1個氨基 酸 ，經(jīng)酶切 電泳鑒定與 同等分 子量 Ma r k e r 大小一致 ， 測 序結(jié)果證 實與 G e n e B a n k公 布 的序列 完全相 符 。并 與 p c D N A 3質(zhì)粒 連接 構(gòu) 建用于真 核細(xì) 胞表達(dá) 質(zhì)粒 ，是基 因工程工作 中獲 得外 源

19、性 基 因的有 效途 徑【 7J ，為進(jìn) 一步獲 得重 組 活性 的 G D NF蛋 白及 用 于 中樞 和周 圍神經(jīng) 系 統(tǒng)疾 病 的基 礎(chǔ) 和 臨床 研 究打 下 了基 礎(chǔ) ， 也有助 于更深入地進(jìn)行 腦 出血的基 因治療研 究?；?因克隆技 術(shù)過 程 復(fù)雜， 我 們在實驗 操作過 程 中根 據(jù)以前 的報道 ， 在方法 學(xué)上也進(jìn)行 了一些改進(jìn) 。對提 取的總 R NA進(jìn)行 純 化 ， 使 1 8S 和 2 8S 兩 條帶 亮度 明顯

20、 ， 純 度 較 高， 有 利 于 c D N A 的 合 成 。 在 c D N A ~ 庫 構(gòu) 建 過 程 中， 經(jīng) 典 途 徑 是 采 用 G u b l e r -H o f f ma n 六 階段 法 ， 但 這 種 方 案過 程 復(fù)雜 ， 代價 昂貴， 一般 實驗 室難 以操 作。本 實驗室采 用 c D N A 第 1 鏈 合成試 劑盒 ， 先合成 c D N A — mR N A雜合體， 依此 為模 板 ， 由 D N

21、A 聚 合酶 從 R N a s e在 c D N A — mR N A雜合體 產(chǎn) 生 的缺 口上， 對 3羥末 端進(jìn) 行 延伸 ， 而 后 由 T d 連接酶對 D N A — D N A雜合體上的缺 口進(jìn)行修補(bǔ)。在 第 1 鏈 合成 中， 將 T E配制 的 mR N A溶 液在 6 8 ℃熱 水 中水 浴 5mi n ， 然 后 在 冰 水 中冷 卻 ， 這 樣 c D N A 第 1鏈 合 成 的 效 率 比不 采 用 變 性

22、以 降 低 mR N A 的二 級 結(jié) 構(gòu) 合成 的效 率 高 。在 第 2鏈 合 成 后， 直接用 P C R擴(kuò)增 目的基 因而 省略 了 c D N A 甲基 化、 接頭制備 、 銜接 子連接 、 凝膠過濾分離等 步驟 ， 簡 化 了實驗過 程， 并得 到 預(yù)期 大 小的 片段 【 8J 。在轉(zhuǎn) 化 具有抗生 素抗性 的感受 態(tài) 細(xì)菌 時 ， 我 們發(fā) 現(xiàn) J M1 0 9菌株轉(zhuǎn)化效率低 ， 培養(yǎng) 皿 中含有 擴(kuò) 增 片段 的 白色

23、 菌 落較難鑒 別， 故 選 用對 轉(zhuǎn) 化 的 D N A 既 無修 飾 作 用 又無限制 作 用 的 E． c o l iD H 5 a ， 明顯 得到 高 轉(zhuǎn)化 率 的含有擴(kuò)增 片段 的 白色 菌落 。對 于 J M1 0 9為何 出 現(xiàn)轉(zhuǎn)化率 明顯低于 E． c o l iD H 5 a 的情 況 ， 我 們認(rèn) 為 可能是該 菌 株對 轉(zhuǎn) 染 D N A 的修 飾 作 用 引起 的， 也 可能與編碼 B 一 半乳糖苷酶 的氨基末端

24、進(jìn)行 a 互 補(bǔ)的 載體不 同， 但具體 機(jī) 制還 不清 楚【 9 ] 。 由于分 子克 隆 是微量操作 技術(shù) ， D N A 樣 品和 酶 的用量 都 很少 ， 需 嚴(yán)格注意 吸樣量的準(zhǔn)確性和 加樣次序并全部放入反 應(yīng)體系中， 吸樣不準(zhǔn) 和 加樣 不全 會造 成 實驗 結(jié)果 的 不理想， 往往需要 重新 進(jìn) 行實驗 。這 一 點在酶 切反 應(yīng) 中顯得尤 為重要 。抽提質(zhì)粒 D N A成 功 的關(guān) 鍵是 把 染色 體 D N A、蛋 白

25、質(zhì) 和 R NA 去 除 干 凈， 獲 得 純 度 較 高 的 質(zhì) 粒 D N A。我們應(yīng) 用 L B豐富 培 養(yǎng)基 ， 用多級 培 養(yǎng) 的方 式提高質(zhì)粒 D N A的產(chǎn) 量。在 抽提 過程 中掌 握變性 和復(fù)性的 時機(jī) ， 既要 使 試 劑 與 染色 體 D N A 充分 作 用使之變性 ， 又要 防止 染 色 體 D N A 斷裂 而 與 質(zhì)粒 D N A相混淆 。提 取 的質(zhì)粒 D N A經(jīng) 乙醇 沉 淀后 ， 使 用 吹風(fēng)機(jī)對準(zhǔn)

26、 離心 管 的尾部 低 檔 吹風(fēng)， 以便 乙醇 和 水分 揮發(fā) ， 2 0mi n后 可 見質(zhì)粒 顏 色 變淡 ， 周 圍無 水 分 ， 但不能 用高檔 吹風(fēng)， 也 不可對準(zhǔn)試管 口或吹風(fēng)時 間過 長， 以免 D N A變成粉末狀 而損害 D N A結(jié)構(gòu) 。參考文獻(xiàn) ：[ 1 ]Wy b r a n i e t zWA ，L a u e rU．D i s t i n c tc o mb i n a t i o no fp u —r i

27、f i c a t i o nme t h o d sd r a ma t i c a l l yi mp r o v e sc o h e s i v e — e n ds u b c l o n i n go fP C Rp r o d u c t s [ J ] ． B i oT e c h n i q u e s， 1 9 9 8 ， 2 4( 3 ) ： 5 7 8 ～5 8 0 ．[ 2 ] H e n d e r s o

28、nC E ， P h i l l i p sH S ， P o i i o c kR A ， e ta 1 ． G D N F ： ap o t e n tf a c t o rf o rmo t o n e u r o n sp r e se n ti np e r i p h e r a ln e v e ra n dmu s c l e [ J ] ． S c i e n c e ， 1 9 9 4 ， 2 2 6 ( 3 ) ：

29、 1 0 6 2 ～1 0 6 4 ．[ 3 ]B a r b a r aF ， Ma c i eJ F ， J u r g e nE ， e ta 1 ． C N Sg l i a la r et a r —g e t sf o rG D N Fa n dn e u r t u r l n [ J ] ． H i s t o c h e mC e l lB i o l ，1 9 9 8 ， 1 1 0 ( 2 ) ： 5 9 5 ～6

30、 0 1 ．【 4 ] C h o i rD I。 L i nQ ， C h a n gY N。a 1 ． D o p a mi n e r g i cn e u r o n sp r o t e c t e df r o m d e g e n e r a t i o nb yg l i a lc e l ll i n e d — d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o rg e n

31、 et h e r a p y [ J ] ． S c i e n c e ， 1 9 9 7 ， 2 7 5( 5 ) ： 8 3 8 ～8 4 1 ．[ 5 ] H i s a s h iK， C h i h o k o S 。 We n R Z ， e t a 1 ． I n d u c t i o n o f g l i a lc e l I l i n e．d e r i v e dn e u r o t r o p h i