草菇開(kāi)傘基因克隆及反義表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、草菇子實(shí)體的發(fā)育大致經(jīng)過(guò)以下六個(gè)階段:針頭期(Pinhead)、小紐扣期(Tinybutton)、紐扣期(Button)、蛋形期(Egg)、伸長(zhǎng)期(Elongation)和成熟期(Mature)<'[1]>.子實(shí)體在不同時(shí)期的生理特征變化顯著,尤其是在蛋形期進(jìn)入伸長(zhǎng)期時(shí)呼吸強(qiáng)度開(kāi)始急劇增強(qiáng),子實(shí)體的形態(tài)也從未破膜的卵形變成開(kāi)傘,失去商品價(jià)值.是什么原因使草菇子實(shí)體在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生這么大的變化?該研究通過(guò)細(xì)胞形態(tài)變化,激素水平變化以及特異基

2、因的表達(dá)等方面進(jìn)行了探索研究.主要研究及結(jié)果如下:1.細(xì)胞伸長(zhǎng)主導(dǎo)伸長(zhǎng)期子實(shí)體菌柄快速伸長(zhǎng)顯微觀察草菇子實(shí)體菌柄細(xì)胞在不同發(fā)育時(shí)期以及菌柄不同部位在蛋形期和伸長(zhǎng)期的細(xì)胞形態(tài)并測(cè)量了細(xì)胞大小變化,同時(shí)通過(guò)菌柄標(biāo)記觀察并測(cè)量了子實(shí)體菌柄的伸長(zhǎng)區(qū)間.結(jié)果表明:在蛋形期草菇主要是通過(guò)細(xì)胞分裂使細(xì)胞數(shù)增加而使子實(shí)體長(zhǎng)大,從伸長(zhǎng)期開(kāi)始,子實(shí)體菌柄伸長(zhǎng)的主導(dǎo)因素是菌柄中上部細(xì)胞的伸長(zhǎng),同時(shí)菌柄頂部細(xì)胞的分裂起輔助作用.2.內(nèi)源激素水平變化與子實(shí)體生長(zhǎng)

3、顯著相關(guān)測(cè)量子實(shí)體菌柄在不同發(fā)育階段的內(nèi)源激素水平變化,結(jié)果顯示:在蛋形期之前,無(wú)論促進(jìn)生長(zhǎng)類激素還是衰老類激素都沒(méi)有明顯的變化;但是在伸長(zhǎng)期,促進(jìn)生長(zhǎng)類激素GA<,1/3>和ZRs急劇上升到頂峰,衰老類激素ABA則急劇下降;到成熟期,GA<,1/3>和ZRs的含量比伸長(zhǎng)期時(shí)明顯下降,但仍維持在較高的水平,ABA的濃度在成熟期時(shí)下降到最低水平.在不同發(fā)育時(shí)期中GA<,1/3>的濃度變化主導(dǎo)GA<,1/3>/ABA的比率變化,GA<,1/

4、3>/ABA可能是主導(dǎo)菌柄細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因素,但子實(shí)體進(jìn)入成熟期后的衰老過(guò)程可能有其它控制衰老的生理因子起關(guān)鍵作用.3.克隆到開(kāi)傘階段特異表達(dá)基因片段通過(guò)抑制性扣除雜交法,以蛋形期子實(shí)體菌柄的Total mRNA為驅(qū)趕子,伸長(zhǎng)期子實(shí)體菌柄的Total mRNA為目的子,克隆子實(shí)體菌柄在伸長(zhǎng)期特異表達(dá)的基因,結(jié)果得到一個(gè)基因片段,測(cè)序并登錄GENBANK進(jìn)行同源性比較,沒(méi)有與此序列相同的基因.以該基因片段為模板合成引物并進(jìn)行基因組DNA擴(kuò)