馬鈴薯塊莖GWD基因的克隆及其表達載體的構建.pdf

1、在高等植物中，淀粉是一種主要的能量儲存物質，它是繼纖維素之后的最豐富的碳水化合物，是人類飲食的主要能源物質。同時淀粉作為一種可生物降解的具有優(yōu)良化學性狀的高聚物，是一種有巨大開發(fā)潛力、應用廣泛的可再生資源。植物體內淀粉上的唯一取代就是淀粉磷酸化，被高度磷酸化作用的磷酸酯淀粉，擁有一些獨特的性能，事實上，淀粉磷酸化作用機制是最近幾年才有一些突破性的進展。α-葡聚糖水合激酶(GWD)是淀粉磷酸化作用酶，在淀粉代謝中起了關鍵的作用，它的豐度直

2、接影響到磷酸酯淀粉的含量。因此，圍繞α-葡聚糖水合激酶進行基因工程操作具有重要的實際意義。本文主要是在馬鈴薯GWD基因克隆、測序、鑒定以及其表達載體的構建方面展開了一些工作。主要的研究結果如下： 1．利用改進的TRizol法，提取馬鈴薯塊莖中的總RNA。由于馬鈴薯塊莖中富含多酚、多糖、多蛋白等干擾因素，所以提取過程中采用β一巰基乙醇、PVP、高濃度NaCl、低濃度乙醇等的綜合處理，消除這些干擾因素，最后能提取完整的高純度的總RN

3、A。 2．根據(jù)馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫提供的序列信息設計引物，利用：RT-PCR從馬鈴薯塊莖中擴增GWD基因。擴增過程中，先分段擴增GWDl、GWD2片段，再以此初級PCR產(chǎn)物為模板，連接擴增成完整的GWD基因。通過對PCR反應體系和反應條件進行優(yōu)化，結合冷、熱啟動PCR和降落式PCR技術，最終從馬鈴薯塊莖中分離出長達4.4 kb的GWD基因片段。 3．將GWD基因克隆到pTA2載體上，獲得重組質粒，經(jīng)測序分析與公開發(fā)表的數(shù)