砂梨果實成熟與軟化相關基因的克隆、表達分析及其表達載體的構建.pdf

1、砂梨（Pyrus pyrifolia Nakai）是我國的重要果樹之一，在我國果樹生產中占有重要的地位.該類型的梨果實不耐貯運，貨架期短，極易造成損失。本文以砂梨果實為試材，利用RACE技術克隆了ACC合酶、ACC氧化酶、木葡聚糖轉葡糖苷酶/水解酶和擴展蛋白等與果實成熟與軟化相關的酶或蛋白的基因的cDNA全長，即Ppy-ACS、Ppy-ACO、Ppy-XTH和Ppy-EXPI、Ppy-EXP2、Ppy-EXP3，構建了砂梨Ppy-ACs

2、和Ppy-ACO的正義和反義表達載體，同時對所克隆基因在果實發(fā)育過程中的表達情況和成熟果實中表達的保守的microRNAs進行了芯片分析，主要結果如下。
　　 1.砂梨ACC合酶基因（Ppy-ACS,EF566865）的cDNA全長為1，939bp，Ppy-ACS核苷酸序列含有5'-UTR為109bp，1，488bp完整的ORF和3’-UTR為342bp，推導編碼495個氨基酸。該氨基酸序列具備ACC合酶7個保守區(qū)和組成該酶活性

3、中心的12個氨基酸殘基，即SLSKDMGFPGLR。以pYPX145載體為基礎，分別將Ppy-ACS編碼區(qū)序列反向和正向插入相應位點構建反義和正義表達載體，命名為pPpy-ACS(-)和pPpy-ACS(+)，目的基因由雙CaMV35S啟動子所控制，分別將這2個表達載體導入根癌農桿菌菌株EHA105。
　　 2.砂梨ACC氧化酶基因（Ppy-ACO，EF451060）的cDNA全長1，225bp，Ppy-ACO核苷酸序列有一個9

4、45bp完整的ORF，5’-UTR為63bp，3’-UTR為217bp，推導編碼314個氨基酸，該序列具備非血紅素二價鐵離子依賴型的氧化/加氧酶類的12個保守氨基酸和催化活性所需的3個氨基酸。將Ppy-ACO編碼區(qū)序列反向插入pYPX145載體，構建了由雙CaMV35S啟動子所控制的雙元表達載體，并成功將表達載體導入根癌農桿菌菌株LBA4404.
　　 3.在砂梨果實發(fā)育期間，Ppy-ACS和Ppy-ACO的表達量隨果實的生長發(fā)

5、育而逐漸地增加，且Ppy-ACO表達量明顯高于Ppy-ACS;1-MCP明顯抑制果實采收后12d內的Ppy-ACS基因表達，降低果實整個采后期Ppy-ACO的表達；外源乙烯對采后果實Ppy-ACS的表達有明顯的促進作用，對Ppy-ACO的表達亦有明顯的促進作用，但在采后末期有所減弱。
　　 4.砂梨木葡聚糖轉葡糖苷酶/水解酶基因（Ppy-XTH,EU432411）的cDNA全長1，248bp，Ppy-XTH核苷酸序列有一個885

6、bp完整的OEF，5’末端起始密碼子ATG起始于74bp，3’-UTR為290bp，其中含有30bp的Ploy+(A)。Ppy-XTH推導編碼294個氨基酸，具備XTH蛋白保守的催化活性部位DEIDFEFLG，N-末端具22個氨基酸組成的信號肽序列，定位于質外體。不同物種該家族基因的氨基酸序列聚類分析表明，Ppy-XTH屬于第1類。實時熒光qRT-PCR實驗結果是Ppy-XTH-果實膨大前期積累較低，在果實膨大期大幅增加，在果實成熟期又

7、顯著下降。
　　 5.砂梨擴展蛋白基因Ppy-EXPl(EF602031)、Ppy-EXP2(FJ619347)和Ppy-EXP3(FJ619348)的cDNA全長分別是1，395bp、1，107bp和1，136bp，分別編碼252個、251個和254個氨基酸，均含有1個組氨酸(His-Phe-Asp，HFD)功能域。以氨基酸序列為基礎構建了12個物種29個擴展蛋白的分子進化樹，Ppy-EXP1和Ppy-EXP2聚為B類，而Pp

8、y-EXP3聚在C類。采用實時熒光qRT-PCR分析了Ppy-EXP1、Ppy-EXP2和Ppy-EXP3在砂梨果實不同生長發(fā)育期的表達情況，Ppy-EXP1和Ppy-EXP2在盛花后0-98d的積累水平很低，在盛花后98d至果實成熟，其表達水平略有上升；Ppy-EXP3從盛花期至果實成熟的表達量一直處于較高水平，至果實成熟時達到最高水平。
　　 6.以所有物種的6，703個microRNAs點制的芯片為基礎，對成熟果實中表達的