砂梨果實成熟相關基因的克隆及其RNAi載體的構建.pdf

1、砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)原產于我國中部、南部和西部各省,適于在溫暖多雨地區(qū)栽培,是原產于中國的四個梨栽培種之一,具有耐熱、抗旱、抗火疫病等優(yōu)良性狀。但其果實大多貯藏性差。如何提高果實耐貯性是解決好砂梨產業(yè)化的關鍵問題。目前的研究主要是針對砂梨果實的生理特點,通過改善果實的貯藏條件和采用一些乙烯抑制劑來延長砂梨果實的貨架期,不能解決根本問題。我們以‘若光’梨為材料,研究適于‘若光’梨葉片離體再生的培養(yǎng)基的種類以及

2、激素配比,克隆‘若光’果實中與成熟相關的基因并構建其RNA干擾載體,將構建的載體分別進行農桿菌介導的梨、番茄、煙草轉化,研究干擾基因在植物體內的表達特性,為將來獲得耐貯砂梨新種質提供了基礎。 1、為了獲得‘若光’梨高效的葉片離體再生體系,和為‘若光’梨的耐貯基因工程研究提供條件,以‘若光’梨葉片為材料,研究了不同激素的種類與濃度組合對砂梨葉片離體再生的影響。結果發(fā)現,以NN69為基本培養(yǎng)基,附加TDZ 1.0 mg/L+IBA

3、0.15 mg/L+AgNO3 0.1 mg/L處理‘若光’梨葉片,暗培養(yǎng)21d后,再置于光照條件下培養(yǎng)30d,‘若光’梨葉片不定芽再生頻率達到了63.2％。 2、根據已登錄的砂梨ACO3(GenBank Accession No.AB042107)序列設計并合成一對特異引物,以‘若光’梨葉片總DNA為模板,利用染色體步移技術擴增基因的上游調控序列?；厥赵撈尾⒖寺〉絧MD19-T載體上,測序后去除接頭和基因編碼序列,得到一段長

4、715bp的上游序列。登陸PLACE數據庫在線進行植物DNA順式作用元件預測與分析,起始位點的上游89bp處有一個TATA-Box核心啟動子元件。另外,序列還存在多個特異調控基因表達的元件。初步判斷其為砂梨果實中ACC氧化酶基因的誘導型啟動子。 3、以‘若光’梨成熟果實為材料,提取總RNA。在ACC氧化酶基因(ACO)mRNA序列同源性較高區(qū)域,用Primer premier5軟件設計一對特異引物,利用RT-PCR克隆得到了40

5、1bp長的片段。經過測序和核苷酸、氨基酸比對,發(fā)現與登錄的ACC氧化酶基因(ACO3)同源性達到99％。據此判斷,得到的片段為砂梨的ACC氧化酶基因序列。根據序列設計兩對分別加了不同酶切位點的正、反基因的特異上下游引物,擴增出ACO的正、反義基因。將ACO反義基因、與副球菌中類胡蘿卜素合成有關的間隔基因YYT(GenBank with accession numbef AY345165)以及ACO正義基因三個片段串聯在一起,并克隆到T載

6、體.經測序鑒定正確后,雙酶酶切下目標片斷并插入到植物表達載體中,構建成能夠表達ACC氧化酶基因的雙鏈RNA的植物載體pYF028。 4、為了研究ACO干擾基因在植物體中的表達特性,通過農桿菌介導法轉化番茄子葉,將侵染的520個外植體先經MS+ZT 1mg/L+IAA 0.5 mg/L+Km 50 mg/L+250 mg/LCef+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L(pH 5.8)篩選培養(yǎng)基,初步篩選出Km抗性芽。將篩選出的抗性芽再

7、經過2次繼代培養(yǎng),共得到34個抗性株系。將抗性株系轉到生根培養(yǎng)基MS+IAA 0.5 mg/L+Km 50 mg/L+Cef250mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7g/L(pH5.8)中生根,經過30d的生根培養(yǎng),共得到了6個生根株系。經過GUS染色、PCR、RT-PCR檢測驗證。初步證實,干擾基因已經整合到番茄的基因組中。進一步進行其乙烯發(fā)生量的檢測,結果發(fā)現,轉干擾基因番茄植株的乙烯釋放量顯著高于對照。 5、以‘若光’梨成熟

8、果實為材料,提取總RNA并反轉錄成cDNA。根據脂氧合酶氨基酸保守區(qū)設計1對簡并引物,采用RT-PCR克隆到1段長827bp的cDNA序列。經Blast比對和DNAstar軟件聚類分析,結果表明,由該序列推導出的氨基酸序列含有脂氧合酶氨基酸保守結構域,與馬鈴薯脂氧合酶基因的氨基酸序列相似性達到77.5％。判斷為砂梨脂氧合酶基因片段,命名為LOX1,并將序列登錄到GenBank,登錄號為EF215448。根據RNAi載體的構建原則,選擇L

9、OX1中一開放閱讀框設計攜帶酶切位點的特異引物,通過PCR擴增LOX1正、反向基因片段,再與YYT間隔區(qū)串連,插入植物表達載體pYF7713中的相應位置。構建了干擾砂梨LOX基因表達的RNAi植物雙元表達載體pYL028。 6、為了研究干擾基因在植物體中的表達特性,我們將構建好的‘若光’梨LOX1干擾表達載體(pYL028),通過農桿菌介導法轉化煙草葉片；將侵染的113個外植體先經MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 m

10、g/L+Km 50 mg/L+Cb 250 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L(pH 5.8)的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng),初步篩選出Km抗性芽?？剐匝吭俳?次繼代培養(yǎng),共得到16個抗性株系。將抗性株系轉到1/2MS+IBA0.1 mg/L+Cb 250 mg/L+Km 50 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L(pH 5.8)的生根培養(yǎng)基中生根,經過30d的生根培養(yǎng),共得到了5個生根株系。經過GUS染色、PCR、RT-PCR檢測驗證

11、,初步證實,干擾基因已經整合到煙草的基因組中。進一步檢測脂氧合酶及相關酶的活性,結果顯示,在低溫脅迫條件下,轉基因植株與未轉基因的對照植株相比,LOX酶的活性被抑制37.8％；SOD、CAT和POD酶活性顯著升高。MDA的含量顯著降低。 7、根據脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)氨基酸保守區(qū)設計一對簡并引物,采用RT-PCR技術從‘若光’梨成熟果實中克隆到一段cDNA特異片段,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,挑單克隆測