大腫瘤基因tml的RNAi載體構(gòu)建及其對(duì)毛白楊的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、RNAi是最近幾年發(fā)展起來(lái)的研究生物體基因表達(dá)調(diào)控與功能的一項(xiàng)嶄新的基因沉默技術(shù)，是由小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物細(xì)胞內(nèi)同源基因的特異沉默(silencing)現(xiàn)象，其本質(zhì)是siRNA與對(duì)應(yīng)的mRNA特異結(jié)合，使其降解，從而阻止了mRNA的翻譯。 植物根癌病世界各地均有發(fā)生，在我國(guó)也廣泛的存在。其病原致瘤農(nóng)桿菌[Agrobacteriumtume faciens(Smithet

2、Towns)Corm對(duì)林木、果樹(shù)、園林花卉等植物均具有廣泛的致病性。楊樹(shù)是我國(guó)北方重要的城市綠化和造林樹(shù)種，是致瘤農(nóng)桿菌危害林木樹(shù)種之一。在受到農(nóng)桿菌侵染后，植株的根部、根莖處甚至莖上形成大小不一的腫瘤，感病植株生長(zhǎng)遲緩，樹(shù)勢(shì)弱，產(chǎn)量少，壽命短，降低木材產(chǎn)量的同時(shí)，也帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此采用先進(jìn)的技術(shù)手段，從基因工程的角度來(lái)抑制腫瘤發(fā)生，研究腫瘤發(fā)生機(jī)制，這對(duì)于植物根癌病的防治、癭木的開(kāi)發(fā)利用等均具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

3、 以野生根癌農(nóng)桿菌I型中克隆得到的523bp長(zhǎng)度的tml基因?yàn)槟康幕颍弥虚g克隆載體pD12，以289bp的pBR322部分序列為間隔區(qū)，使tml反義基因片段、PBR322和tml正義基因片段串聯(lián)，將構(gòu)成的全長(zhǎng)1300bp的DNA片段插入植物雙元載體pCAMBIA1302中，成功構(gòu)建基因tml的RNAi載體pHR2122-1302，此可讀框架通過(guò)組成型啟動(dòng)子CaMV35S啟動(dòng)，另外此載體帶有真核內(nèi)含子的GFP標(biāo)記基因，轉(zhuǎn)基因植物可通

4、過(guò)熒光鑒定。 選用培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.05 mg/L附加蔗糖3％，瓊脂0.6％作為毛白楊雄株遺傳轉(zhuǎn)化用的芽分化培養(yǎng)基，之后接種到生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.5mg/L+1.5％蔗糖+6g/L瓊脂上利于植株生根。利用野生農(nóng)桿菌侵染植株，并通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株插入基因iaaH、tml的檢測(cè)和對(duì)冠癭堿的檢測(cè)，確定得到3株野生農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株。 通過(guò)分析影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素，確立高效遺傳轉(zhuǎn)化

5、體系，侵染時(shí)間控制在5-10min，共培養(yǎng)2-3天，共培養(yǎng)培養(yǎng)基中去除COCl<,2>·6H<,2>O，卡那霉素選擇壓為50mg/L。 以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法將植物雙元載體pHR2122-1302轉(zhuǎn)化入毛白楊雄株-D，通過(guò)50mg/L卡那霉素篩選和GFP檢測(cè)，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因植株在形態(tài)上有一定程度的變異，具體數(shù)據(jù)以及其對(duì)外源野生農(nóng)桿菌的影響正在進(jìn)一步檢測(cè)當(dāng)中。 對(duì)室外瘤體的研究發(fā)現(xiàn)，tml-RNAi載體對(duì)瘤